7.6: Ejercicio 4 - PCR de colonias de levadura

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Para preparar las reacciones, primero mezclarás los pares de cebadores con un número MUY PEQUEÑO de células de levadura que transfieras de una colonia al tubo con la punta de una micropipeta P-20 o P-200. La colonia y los cebadores se calentarán luego a 98° C durante 15 minutos para romper
las células de levadura. En ese punto, agregará un volumen igual de una mezcla maestra de PCR, que contiene nucleótidos y la polimerasa Taq, a cada tubo. Los tubos serán devueltos entonces al termociclador para una reacción típica de PCR.

1. Marcar los tubos de PCR. Los tubos son muy pequeños, así que desarrolla un código que puedas usar para identificar los tubos. (No olvides incluir el código en tu libreta. El código debe indicar qué cebadores y cepas se mezclan en cada tubo.)

2. Preparar las mezclas de imprimación. El volumen final de las reacciones PCR será de 20 μL. La mezcla de imprimación representa la mitad del volumen final, o 10 μL. Las concentraciones de stock de los cebadores son de 2.0 μM cada una. Pipetear 5.0 μL cada uno de los dos cebadores que le gustaría usar en cada tubo de PCR. ¿Cuál será la concentración final de cada cebador en la reacción PCR real?

Nota

Debido a la extraordinaria sensibilidad de las reacciones de PCR, es muy importante no contaminar de manera cruzada los tubos con cebadores no deseados. Cambie las puntas entre cada transferencia de imprimación.

3. Transferir una pequeña cantidad de células de levadura a cada tubo de PCR. Toque ligeramente la punta de una micropipeta P20 o P200 a una colonia de levadura. Gira la punta de la micropipeta en el tubo que contiene tu mezcla de imprimación para liberar las células. El error más común es transferir demasiadas células de levadura, lo que interferirá con la reacción PCR. La cantidad correcta de levadura cabrá en la punta de un alfiler.

4. Lisar las células de levadura. Colocar los tubos en el termociclador por 15 min a 98° C.

5. Configurar las reacciones de PCR. Retire los tubos del termociclador y agregue 10 μL de mezcla maestra de PCR a cada tubo.

6. Amplificar las secuencias del gen diana. Regresar los tubos al termociclador e iniciar el programa de PCR.

Nuestros termocicladores están establecidos para el siguiente programa:

Un ciclo de desnaturalización: 95°C durante 2 minutos

35 ciclos de desnaturalización, recocido y extensión:

95°C por 30 seg.

55°C por 30 seg.

72°C por 1 minuto

Un ciclo de extensión: 72°C por 10 minutos