13.4: Ejercicio 2 - Preparación de extractos celulares
- Page ID
- 54108
\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)
Preparar las células para la extracción
- Reúna los 6 cultivos de su equipo y anote qué cultivos contienen glucosa y qué cultivos contienen galactosa.
- Determinar la concentración celular o cada cultivo. Vórtice los tubos y transfiera 100
μL de cada cultivo celular a 900 μL de agua desionizada. Mida la OD600 de cultivos en el espectrofotómetro. Anote los valores en su cuaderno. Se referirá a ellos más adelante al interpretar sus geles SDS-PAGE (Capítulo 14). - Transfiere 1.5 mL de tus cultivos a tubos de microcentrífuga etiquetados. Recoger las células por centrifugación durante 1 minuto usando la microcentrífuga a velocidad máxima. Retirar y desechar el sobrenadante.
- Enjuague las celdas. Agrega 1 mL de agua desionizada a cada tubo. Resuspender los pellets celulares extrayendo suavemente las células dentro y fuera de la punta de una micropipeta, teniendo cuidado de prevenir la lisis prematura de las células. Esta etapa de enjuague elimina las proteínas del medio de cultivo que pueden contaminar el sedimento celular. Centrifugar nuevamente por 1 minuto a velocidad máxima.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μL de agua desionizada.
Preparar el extracto proteico
- Agregar 100 μL de NaOH 0.2N a cada tubo, e incubar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. (La adición de NaOH no lisa las células, pero las hace más permeables y frágiles).
- Vuelva a sedimentar las células en la microcentrífuga. Retirar y desechar el sobrenadante. (Las proteínas que te interesan están en el pellet.)
- Vuelva a suspender las células en 50 μl 2 X tampón de muestra SDS-PAGE. * Asegúrese de que los tubos estén bien tapados. INMEDIATAMENTE coloque los tubos en un baño de agua hirviendo. Dejar las celdas en el baño de agua durante 3 minutos. Este tratamiento desnaturaliza eficazmente las proteínas. Las células de levadura contienen muchas proteasas que podrían degradar otras proteínas celulares, por lo que es importante que las proteasas se desnaturalizan antes de que tengan la oportunidad de atacar a otras proteínas celulares.
NOTA: El tampón de muestra SDS-PAGE 2 X contiene 2-mercaptoetanol (también conocido como b-mercaptoetanol , o BME). Tenga la precaución adecuada y trabaje rápidamente al manipular este reactivo. El BME es un reactivo volátil con un fuerte olor que recuerda a los peces podridos. - Después de hervir, almacene las muestras en el congelador para uso futuro.
*2 x tampón de muestra SDS-PAGE consiste en:
Tris/HCl 120 mM, pH 6.8
10% glicerol (el glicerol es significativamente más denso que el agua) 4% SDS
8% 2-mercaptoetanol
0.004% azul de bromofenol (un colorante de seguimiento para electroforesis)