15.6: Ejercicio 2 - Inmunodetección

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Este es un procedimiento de varios días. El tiempo puede variar para diferentes clases. Las membranas se rehidratan y se tratan con reactivos de bloqueo

Con GUANTES, desenvuelva la mancha seca de la envoltura de plástico. Utilice los patrones preteñidos para identificar el lado de la membrana al que se unen las proteínas. Sumerja la membrana en metanol con este lado hacia arriba. Agitar suavemente la membrana balanceándose a mano durante 30-60 segundos hasta que la membrana haya sido uniformemente mojada con metanol. Decantar el metanol en el recipiente apropiado y llenar la bandeja hasta la mitad con agua desionizada. Agitar suavemente la membrana por un minuto adicional.
Decantar el agua y reemplazarla con suficiente TBS-T (solución salina amortiguada con Tris que contiene 0.05% de Tween 20) para cubrir la mancha. Colocar la mancha sobre una plataforma mecedora. Equilibrar la mancha en TBS-T durante 5 minutos con balanceo lento. Al cabo de 5 minutos, drene el TBS-T.
Vierte suficiente solución bloqueante (leche descremada al 5% en TBS-T) sobre la mancha para cubrirla.
Cubra la bandeja con un pequeño trozo de papel plástico. Etiquete la bandeja con claridad y colóquela en una plataforma mecedora en la cámara frigorífica. La mancha debe flotar libremente en la bandeja para que ambos lados se laven. Incubar la mancha durante al menos una hora o hasta 24 horas a 4° C.

Las membranas se lavan y se incuban con anticuerpo primario (~24 horas)

Localiza tu mancha en la cámara frigorífica y tráela de vuelta a la sala de laboratorio.
Retire la envoltura plástica del recipiente que contiene la mancha y vierta la solución de bloqueo. ¡GUARDE la envoltura de plástico! ¡Lo necesitarás para volver a tapar el contenedor!
Agrega suficiente TBS-T para cubrir la mancha y coloca el recipiente sobre la plataforma mecedora. Rock por 5 minutos.
Vierta el TBS-T. Agregar 15 mL de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo.
Cubra el recipiente con la misma pieza de plástico y coloque la bandeja sobre la plataforma mecedora en la cámara fría de 4° C. Asegúrese de que la mancha flote libremente en la bandeja y que los estándares estén en la cara superior de la mancha. Incubar durante la noche a 4° C con balanceo lento. NOTA: El momento de este paso es el más crítico en el procedimiento. El acortamiento del tiempo de incubación con el anticuerpo primario puede reducir la sensibilidad de la transferencia Western.

Fijación y detección de anticuerpos secundarios (1.5-2 horas)

Localiza tu mancha en la cámara frigorífica y llévala a tu aula de laboratorio.
Escurrir cuidadosamente el anticuerpo de la mancha en el tubo de ensayo marcado como “Anticuerpo primario usado”. (Los anticuerpos son caros. Afortunadamente, las soluciones se pueden reutilizar.)
Llena la bandeja con la mancha aproximadamente medio llena con TBS-T. Colocar la bandeja sobre una plataforma mecedora y lavar la membrana durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo primario no unido. Drene el TBS-T cuando el lavado esté completo.
Repita el paso 3 una vez más, para un total de dos lavados.
Agregar suficiente anticuerpo secundario para cubrir la mancha e incubar la membrana durante 1 hora con suave balanceo a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario, que se conjuga a la peroxidasa de rábano picante (HRP), se ha diluido en TBS-T.
Cuidadosamente drene el anticuerpo de la mancha en el tubo de ensayo marcado como “Anticuerpo secundario usado”.
Lavar la membrana 3 veces por 5 minutos cada una con TBS-T, como en el paso 3.
Drene el TBS-T de la mancha. Usando una micropipeta P1000, cubrir la mancha con 1 mL de 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB), un sustrato colorigénico para HRP. Deje que el color continúe desarrollándose hasta que se manifiesten bandas distintas. Las bandas probablemente se harán evidentes en cuestión de minutos. No permita que la transferencia se desarrolle en exceso, cuando las bandas inespecíficas se hacen evidentes.

9. Detener el desarrollo del color diluyendo el sustrato con un exceso de agua desionizada. Drene el sustrato diluido en el contenedor de desechos.

10. Permita que la mancha se seque sobre un trozo de papel de filtro. Graba tus datos con la cámara de tu celular.