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4.4: Ejercicio 1 - Placas de rayas

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    A los microbiólogos les gusta comenzar sus experimentos con una sola colonia, porque las células de una colonia son la progenie de una sola célula. Una preocupación en todos los experimentos genéticos son las mutaciones desconocidas que surgen espontáneamente y pueden afectar el fenotipo que se estudia. Las mutaciones espontáneas surgen constantemente en todas las células, con una tasa de aproximadamente 10-8/base/ generación. Para S. cerevisiae, con un genoma de 12 Mbp, la mayoría de las células habrán acumulado al menos una mutación en el momento en que hayan sufrido 9-10 divisiones. Una colonia, que cuenta con cientos de millones de células, es por lo tanto una población de organismos genéticamente muy similares, pero no completamente idénticos.

    Los investigadores suelen utilizar placas de rayas para aislar colonias individuales. Una placa de rayas es en realidad una dilución en serie de un cultivo existente en medios sólidos. Los investigadores comienzan una racha recogiendo una pequeña muestra de levadura u otro microorganismo con un instrumento estéril, que podría ser un asa de platino, un palillo de dientes o una punta de micropipeta. Luego esparcen el cultivo haciendo una serie de trazos en zig-zag a través de la superficie de la placa. El número de células en el asa o palillo disminuye a medida que avanza la racha. En consecuencia, las rayas aparecen más gruesas en sus puntos de partida, y el grosor de la racha disminuye hasta que es posible detectar colonias individuales bien aisladas cerca del final de la racha. Debido a que puede ser difícil resolver colonias a partir de una sola racha, muchos laboratorios utilizan una serie de rayas en la misma placa para separar las colonias. Cada nueva racha
    se realiza con un bucle recién esterilizado que recoge las células cruzando las huellas de la racha anterior, antes de comenzar una nueva serie de zig-zags. En nuestros experimentos, utilizaremos un protocolo de múltiples estrías, que nos permite cultivar múltiples cepas en una sola placa de medio de cultivo. (Ver la figura a continuación.) Las placas de rayas que prepare contendrán las existencias para futuros experimentos. A medida que rayas tus cepas, presta mucha atención a los detalles para evitar la contaminación cruzada o confusión sobre las identidades de cepas individuales.

    Placa de rayas con tres sectores.

    La placa se ha dividido en tres sectores claramente etiquetados. Se utilizaron tres rayas para extender las células en cada sector. La tercera racha en cada sector contiene colonias bien separadas que pueden ser utilizadas para experimentos genéticos.

    Screen Shot 2019-01-02 a las 11.49.36 PM.png Screen Shot 2019-01-02 a las 11.50.46 PM.png

    Preparación de una placa de rayas

    1. A su equipo se le asignarán tres cepas diferentes de S. cerevisiae met para cultivar. Las cepas de stock que usarás han sido cultivadas a una alta densidad en medio YPD líquido. Reunir los cultivos de YPD de las cepas parentales a propagar, un asa de inoculación de platino y una placa de agar con medio YPD fresco. Esta placa servirá como placa de stock de su equipo para el semestre.
    2. Divida la placa de stock de su equipo en sectores marcando la parte inferior de la placa con un marcador mágico. Evidentemente etiquetar cada sector con un código para la cepa que se rayará en él. Ya que se realizarán series de tres vetas dentro de cada sector, tal y como se describe en la página anterior. Mantenga las etiquetas en el borde de la placa y use letras minúsculas. Anote sus iniciales y la fecha. Screen Shot 2019-01-02 a las 11.54.54 PM.png
    3. Esterilizar el asa de inoculación manteniéndolo en la llama de un quemador Bunsen hasta que brilla de color rojo. Enfríe el asa tocando brevemente la superficie de su placa de agar antes de continuar. (¡Un bucle caliente matará las células de levadura con las que entra en contacto!)
    4. Las células en sus cultivos de stock pueden haberse asentado con el tiempo. Resuspender las celdas usando el mezclador vorticio. Trabajando rápidamente, retire la tapa del primer tubo de cultivo. Sumerja el asa esterilizada en el cultivo, retire el asa y vuelva a colocar la tapa en el tubo de cultivo.
    5. Transfiera las celdas al sector debidamente etiquetado en su placa de almacenamiento. Primera racha: hacer varios zigzags a través del borde exterior del sector con el bucle. Toca ligeramente la superficie del agar mientras mueves el palillo de dientes. Piensa en empujar un disco de hockey a través de una pista de hielo, en lugar de cavar una zanja. ¡NO quieres poner marcas de pista en el agar! Vuelva a colocar la tapa.
    6. Esterilizar el asa en la llama y enfriarlo en la superficie del agar antes de comenzar la segunda racha. Hacer una segunda racha vertical desde el borde de la placa hacia el centro, permaneciendo dentro del sector. La racha debería cruzar los zigzags en la primera racha. Cierre la tapa y vuelva a esterilizar (y enfriar) el bucle.
    7. Tercera racha: realizar una tercera serie de zigzags que cruzan de ida y vuelta sobre la segunda racha recta, comenzando en el borde exterior del plato y moviéndose hacia el centro. Tenga cuidado de mantenerse dentro del sector. Cierre la tapa y esterilice el lazo.
    8. Repita los pasos 4-7 para cada uno de sus cultivos líquidos.
    9. Invertir la placa e incubarla a 30° C hasta que las colonias individuales sean visibles, lo que suele ser de 24 a 48 horas.


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