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4.6: Ejercicio 3 - Estimación de densidades celulares con un espectrofotómetro

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    El espectrofotómetro proporciona una manera “rápida y sucia” de estimar la densidad de células
    en un cultivo. A diferencia de las placas puntuales, que deben incubarse durante varios días antes de que aparezcan las colonias, las lecturas del espectrofotómetro se pueden convertir instantáneamente en densidades celulares. Por otro lado, el método no discrimina entre células vivas y muertas. El método espectrofotométrico se basa en la dispersión de la luz por las células en el cultivo. Cuando la luz en un espectrofotómetro golpea una partícula grande como una célula, los rayos de luz se desvía de una trayectoria recta y estos rayos de luz pueden no llegar al detector. Cuanto mayor sea el número de células en una muestra, mayor será la dispersión de la luz. La capacidad de dispersión de luz de una célula depende de su tamaño y geometría, por lo que es necesaria una curva de calibración para extrapolar las mediciones de densidad óptica al número de celdas. Por ejemplo,
    el mismo número de células de levadura dispersaría la luz más que el mismo número de células bacterianas, debido a que las células bacterianas son mucho más pequeñas.

    La dispersión de la luz se mide con el espectrofotómetro ajustado para informar la absorbancia. Debido a que los principios utilizados para medir la dispersión y absorbancia de la luz son diferentes, la cantidad de luz dispersada por una solución se conoce como su “densidad óptica” en lugar de su “absorbancia”. La densidad óptica de una muestra analizada a 600 nm se abrevia OD 600, con el subíndice indicando la longitud de onda utilizada para la medición.

    Estimación de densidades celulares con el espectrofotómetro

    Siga las indicaciones del Capítulo 2 para operar el GeneSys 20.

    1. Encienda el espectrofotómetro GeneSys 20. Ajustar la longitud de onda del monocromador a 600 nm.

    2. Llenar una cubeta con 1.0 mL de agua desionizada para que sirva como blanco. Orientar la cubeta en el soporte de manera que el lado plano de la cubeta se oriente hacia la parte frontal del instrumento. Cierre la tapa y presione el botón “0 Abs/ 100% T” para establecer un valor de línea base para mediciones adicionales.

    3. Reemplazar el blanco con una cubeta que contenga 1 mL de cultivo sin diluir. Cierre la tapa y
    lea el OD600. Registre este valor en su cuaderno de laboratorio. Si la densidad óptica de la muestra es mayor a 1.0, diluir la muestra 1:10 con agua desionizada y leer nuevamente la densidad óptica. (La relación lineal entre el OD 600 y la densidad celular se pierde cuando los valores de OD 600 superan 1.0) Registre el nuevo valor en su cuaderno de laboratorio, observando cómo diluyó su muestra. Deseche todo el material celular en el contenedor de desechos líquidos blancos.

    4. Repita el paso 3 con cada una de sus culturas.

    5. Calcular una densidad celular aproximada para cada muestra, asumiendo que una DO 600 de 1.0 corre- esponde a aproximadamente 1.3 x 10 7 células/mL. Utilice solo datos donde el OD 600 sea menor a 1.0 para estos cálculos.


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