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7.1: Resumen de reacción en cadena de la polimerasa

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) revolucionó la biología molecular. Con la PCR, los investigadores contaban con una herramienta para amplificar secuencias de ADN de interés a partir de cantidades extremadamente pequeñas
    de un molde de ADN. De hecho, se pueden sintetizar miles de millones de copias a partir de una única molécula de ADN en una reacción de PCR típica. El desarrollo de la PCR nació de la investigación sobre ADN polimerasas y el descubrimiento de ADN polimerasas termoestables capaces de soportar tratamientos térmicos prolongados que desnaturalizan la mayoría de las proteínas (Sakai et al. , 1988). Hoy en día, la PCR es una técnica estándar que se usa ampliamente para analizar moléculas de ADN y construir nuevas moléculas recombinantes.

    Las ADN polimerasas termoestables son centrales para la PCR. En la primera descripción de la PCR se utilizó
    una ADN polimerasa de E. coli, la cual se desnaturalizó y tuvo que ser reemplazada después de cada ronda de síntesis de
    ADN (Sakai et al. , 1985). El procedimiento mejoró mucho al reemplazar la polimerasa de E.
    coli
    por una ADN polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria que prospera
    en las aguas termales del Parque Nacional Yellowstone. La ADN polimerasa de T. aquaticus, o Taq polimerasa, funciona mejor a temperaturas de 70-75° C y puede soportar incubación prolongada (pero no indefinida) a temperaturas superiores a 90° C sin desnaturalización. A los pocos años, la polimerasa Taq había sido clonada y sobreexpresada en E. coli, expandiendo en gran medida su disponibilidad. Hoy en día, la selección de polimerasas disponibles para PCR ha aumentado drásticamente, ya que se han identificado nuevas ADN polimerasas en otros organismos termófilos y se han introducido modificaciones genéticas en la polimerasa Taq para mejorar sus propiedades.

    La PCR implica múltiples rondas de síntesis de ADN de ambos extremos del segmento de ADN que se está amplificando. Recordemos lo que sucede durante la síntesis de ADN: un cebador oligonucleotídico monocatenario se une a una secuencia complementaria del ADN. Esta región bicatenaria proporciona
    un anclaje para la ADN polimerasa, que extiende el cebador, desplazándose SIEMPRE en la dirección 5' a 3'. Los investigadores controlan los sitios de inicio para la replicación del ADN suministrando oligonucleótidos para que sirvan como cebadores para la reacción (se muestra a continuación para Tu gen favorito Yfg). Para diseñar cebadores de PCR, los investigadores necesitan información precisa de la secuencia para los sitios de unión del cebador en el ADN diana. (Nota: La información de secuencia no es necesaria para toda la secuencia que se amplificará. La PCR se usa a menudo para identificar secuencias que ocurren entre dos sitios de unión a cebadores conocidos). Se requieren dos cebadores para la PCR. Un cebador se une a cada hebra de la hélice de ADN.

    La PCR comienza con un periodo de desnaturalización de varios minutos, durante el cual la mezcla de reacción se incuba a una temperatura lo suficientemente alta como para romper los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de la hélice de ADN. La desnaturalización efectiva es crítica, ya que la ADN polimerasa requiere ADN monocatenario como molde. El segmento de desnaturalización inicial es más largo que los pasos de desnaturalización posteriores, porque los moldes biológicos para PCR, como el ADN genómico, suelen ser moléculas largas y complejas unidas por muchos enlaces de hidrógeno. En ciclos de PCR posteriores, los productos (más cortos) de ciclos previos se convierten en los moldes predominantes.

    Después de la desnaturalización inicial, la PCR implica una serie de 30-35 ciclos con tres segmentos, realizados a diferentes temperaturas. Las reacciones de PCR se incuban en termocicladores que ajustan rápidamente la temperatura de un bloque de reacción metálico. Un ciclo típico incluye:

    • un paso de desnaturalización - comúnmente 94° C
    • una etapa de hibridación del cebador - comúnmente 55° C
    • un paso de extensión - comúnmente 72° C

    Las reacciones de PCR incluyen múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión.

    la secuencia del cebador. Las ADN polimerasas se vuelven más activas a la temperatura de extensión, que está más cerca de su temperatura óptima. Los investigadores adaptan las temperaturas y el tiempo de los pasos anteriores para acomodar diferentes cebadores, moldes y ADN polimerasas.

    Los productos de PCR del tamaño deseado se acumulan exponencialmente

    La PCR es de hecho una reacción en cadena, ya que la secuencia de ADN de interés se duplica aproximadamente
    con cada ciclo. En diez ciclos, una secuencia se amplificará ~1000 veces (2 10 =1024). En veinte ciclos, una secuencia se amplificará ~millones de veces. En treinta ciclos, una secuencia puede amplificarse teóricamente ~mil millones de veces. Las reacciones de PCR en el laboratorio generalmente implican 30-35 ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión. Para entender la PCR, es importante enfocarse en los primeros ciclos. Los productos de PCR del tamaño deseado aparecen primero en el segundo ciclo. La amplificación exponencial del producto de PCR pretendido comienza en el tercer ciclo.

    Durante el primer ciclo, las ADN polimerasas termoestables sintetizan ADN, extendiendo los extremos 3' de los cebadores. Las ADN polimerasas son enzimas procesativas que continuarán sintetizando ADN hasta que literalmente se caigan del ADN. En consecuencia, las moléculas de ADN complementarias sintetizadas en el primer ciclo tienen una amplia variedad de longitudes. Cada uno de los productos, sin embargo, ha definido la posición de partida, ya que comienza con la secuencia del cebador. Estas secuencias “ancladas” se convertirán en moldes para la síntesis de ADN en el siguiente ciclo, cuando aparezcan por primera vez productos de PCR de la longitud pretendida. El molde de inicio para PCR continuará copiándose en cada ciclo posterior de PCR, produciendo dos nuevos productos “anclados” con cada ciclo. Debido a que las longitudes de los productos “anclados” son bastante variables, sin embargo, no serán detectables en los productos finales de la reacción PCR.

    Las cadenas de ADN de la longitud prevista aparecen primero durante el segundo ciclo. La replicación a partir de los fragmentos “anclados” genera productos de PCR de la longitud pretendida. El número de estos fragmentos de longitud definida se duplicará en cada nuevo ciclo y rápidamente se convertirá en el producto predominante en la reacción.

    La mayoría de los protocolos de PCR implican 30-35 ciclos de amplificación. En los últimos ciclos, los productos de PCR deseados ya no se acumulan exponencialmente por varias razones. Como en cualquier reacción enzimática, los sustratos de PCR se han agotado y las repetidas rondas de incubación a 94° C han comenzado a desnaturalizar la polimerasa Taq.

    La hibridación de cebadores es crítica para la especificidad en PCR

    Un buen diseño de cebadores es fundamental para el éxito de la PCR. La PCR funciona mejor cuando los cebadores son altamente específicos para la secuencia diana en el ADN molde. El cebado erróneo ocurre cuando los cebadores se unen a secuencias que solo son parcialmente complementarias, lo que hace que la ADN polimerasa copie las secuencias de ADN incorrectas. Afortunadamente, los investigadores suelen ser capaces de ajustar parámetros experimentales para maximizar la probabilidad de que los cebadores hibriden con las dianas correctas.

    Los cebadores de PCR son típicamente oligonucleótidos sintéticos de entre 18 y 25 bases de longitud. Al diseñar una imprimación, los investigadores consideran su T m, la temperatura a la que se fundirá la mitad de los híbridos formados entre el cebador y el molde. En general, la estabilidad térmica de un híbrido aumenta con la longitud del cebador y su contenido de GC. (Recordemos que un par GC-base está estabilizado por tres enlaces H, en comparación con dos para un par AT). La siguiente fórmula proporciona una estimación aproximada de la T m de híbridos oligonucleotídicos. En esta fórmula, n se refiere al número de nucleótidos, y la concentración de cationes monovalentes se expresa en unidades molares (M).


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