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7.2: Proyecto de deleción del genoma de Saccharomyces

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    La publicación de la secuencia del genoma de levadura abrió nuevas oportunidades para los genetistas de levadura. Conociendo la secuencia de ADN del genoma de la levadura, los genetistas podrían ahora aprovechar la alta frecuencia con la que las levaduras intercambian genes por recombinación homóloga para generar mutantes de su propio diseño. La recombinación homóloga ocurre normalmente durante la meiosis y durante ciertos tipos de reparación del ADN. Durante la recombinación homóloga, dos secuencias de ADN estrechamente relacionadas se alinean entre sí, aparecen roturas en las moléculas de ADN y el intercambio de cadenas ocurre cuando se reparan las roturas. La recombinación homóloga permite
    a los investigadores reemplazar un gen cromosómico con un constructo de ADN de diseño propio. Para usar esta estrategia, los investigadores primero construyen un casete de reemplazo en el que un gen marcador está flanqueado por secuencias que son idénticas a las secuencias de ADN cromosómico a ambos lados del gen diana de levadura. La secuencia se introduce luego en las células por transformación química (Capítulo 12) o por electroporación. Las células transformadas que han incorporado los casetes de reemplazo en el ADN cromosómico se pueden identificar seleccionando el gen marcador en el casete de reemplazo.

    El Proyecto de Eliminación del Genoma de Saccharomyces (SGDP) utilizó este enfoque para reemplazar sistemáticamente cada uno de los ORF previstos en el genoma de S. cerevisiae con un gen de resistencia a kanamicina (KAN R). Para cada ORF, los investigadores utilizaron una serie de reacciones de PCR (abajo) para construir casetes en los que el gen KAN R estaba flanqueado por secuencias cortas de ADN que ocurren aguas arriba y aguas abajo del ORF diana en el cromosoma de S. cerevisiae. Luego se utilizaron los casetes para transformar la cepa BY4742 (Brachmann et al. , 1998). Las cepas que habían incorporado el gen KAN R se seleccionaron en placas que contenían análogos de kanamicina (Winzeler et al., 1999).

    Las cepas de S. cerevisiae que estamos usando en nuestros experimentos forman parte de la colección SGDP de mutantes de deleción. En este laboratorio, utilizará PCR para identificar qué genes MET han sido alterados en sus cepas. Los cebadores de PCR fueron diseñados y probados por el SGDP para verificar las identidades de las cepas. Los cebadores disponibles incluyen dos cebadores específicos de genes (GSP) para cada uno de los genes MET. Uno de los GSP, el Cebador A de GSP, se localiza 200-400 pb aguas arriba del codón de iniciación. El segundo GSP, el Cebador B de GSP, es un cebador antisentido que se une dentro del ORF. También tenemos un cebador antisentido que se une a 250 pb dentro del gen KAN R (KAN Primer B).


    This page titled 7.2: Proyecto de deleción del genoma de Saccharomyces is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.