Saltar al contenido principal
Library homepage
 
LibreTexts Español

10.1: Los plásmidos están compuestos por elementos funcionales

  • Page ID
    53678
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    La replicación del plásmido depende de las polimerasas de la célula huésped

    Los plásmidos se encuentran naturalmente en muchos microorganismos. Los plásmidos pueden transferirse entre especies por transformación o conjugación, pero generalmente tienen un rango de hospedadores restringido. Cuando piensas en plásmidos, probablemente también piensas en bacterias, pero los plásmidos no están restringidos a bacterias. De hecho, la mayoría de las cepas de S. cerevisiae portan un plásmido grande conocido como plásmido de 2 micras o 2 μm. Múltiples copias del plásmido de 2 μm suelen estar presentes en el núcleo de una célula de levadura, y el número de plásmidos es estable a través de muchas rondas de división celular.

    Aunque los plásmidos se replican independientemente del ADN cromosómico, se basan en enzimas hospedadoras para catalizar su replicación. Las ADN polimerasas hospedadoras se unen a una secuencia de origen de replicación (ori) en el plásmido. Los plásmidos que se replican en bacterias tienen secuencias ori que se unen a la ADN polimerasa bacteriana, mientras que los plásmidos que se replican en levadura tienen distintas secuencias ori
    que se unen a la ADN polimerasa de levadura. Los plásmidos que estamos utilizando a veces se denominan “vectores lanzadera”, porque son capaces de replicarse en más de un tipo de célula. Nuestros plásmidos contienen el ori del plásmido, pBR322, que se replica en E. coli a un número de copias de 30-40. Los plásmidos también contienen el ori del plásmido de 2 μm de S. cerevisiae descrito anteriormente. En esta clase, vamos a propagar los vectores lanzadera en bacterias, porque las bacterias crecen más rápidamente que las levaduras y porque el rendimiento de plásmido a partir de bacterias es mayor que el rendimiento de la levadura. Cosecharemos los plásmidos de bacterias y luego los usaremos para transformar células de levadura.

    Los plásmidos de laboratorio llevan marcadores seleccionables

    Los plásmidos ponen un peaje en el metabolismo de la célula huésped, y normalmente se perderían de sus células hospedadoras si no confieren alguna ventaja selectiva al huésped. Por lo tanto, los plásmidos utilizados en biología molecular portan genes para marcadores seleccionables, que permiten que las células transformadas crezcan en condiciones no premisas, condiciones en las que las células no transformadas son incapaces de crecer. Nuestros plásmidos contienen el gen b-lactamasa (amp R), que permite que E. coli crezca en presencia

    de ampicilina, un antibiótico que interfiere con la síntesis de la pared celular bacteriana. Los plásmidos también contienen el gen URA3 de S. cerevisiae, que permite que mutantes ura3 como BY4742, la cepa parental de nuestros mutantes, crezcan en ausencia de uracilo solo después de que se transformen con plásmidos (Capítulo 12).

    Promotores controlan la transcripción de secuencias codificantes para proteínas de fusión

    Los plásmidos que usaremos este semestre contienen genes MET que han sido clonados en plásmidos directamente aguas abajo de la secuencia promotora para el gen GAL1 de levadura (Johnston, 1987). La transcripción del promotor GAL1 normalmente está controlada por proteínas reguladoras que detectan los niveles de glucosa y galactosa en levaduras (Capítulo 13). En los plásmidos, el promotor GAL1 se ha colocado en los extremos 5' de las secuencias codificadoras de proteínas para las proteínas Met de S. cerevisiae, sus ortólogos de
    S. pombe o lacZ bacteriana. La presencia del promotor GAL1 le permitirá manipular la expresión de las proteínas Met o lacZ en células de levadura transformadas.

    La siguiente figura muestra un mapa del plásmido pYES2.1. Los ORF para las proteínas S. cerevisiae y S. pombe fueron clonados individualmente en el plásmido pYES2.1 por estudiantes en una clase de laboratorio avanzado y por el personal de BIOL2040. En todos los casos, los ORF se clonaron aguas abajo del promotor GAL1 (elemento 5 en el diagrama).

    Las proteínas expresadas a partir de plásmidos pYES2.1 son proteínas de fusión que son ~5 k Da más largas que las secuencias codificantes naturales. Durante los procesos de clonación utilizados para construir los plásmidos de sobreexpresión, los investigadores eliminaron los codones de parada naturales de los ORF para que la transcripción continuara en secuencias codificadas por plásmidos. La secuencia de pYes agrega etiquetas C-terminales que pueden ser utilizadas para procedimientos como Western blots (Capítulo 15) o purificación de proteínas. Estas etiquetas serán discutidas con mayor detalle en el Capítulo 13.


    This page titled 10.1: Los plásmidos están compuestos por elementos funcionales is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.