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11.1: Endonucleasas de restricción

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    Los sistemas de restricción/modificación bacteriana protegen contra invasores

    El descubrimiento de enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción (RE), fue fundamental para el desarrollo de la clonación molecular. Los RE ocurren naturalmente en bacterias, donde reconocen específicamente tramos cortos de nucleótidos en el ADN y catalizan roturas bicatenarias en o cerca
    del sitio de reconocimiento (también conocido como sitio de restricción). Hasta la fecha, se han descrito miles de RE con distintas especificidades. Quizás te preguntes por qué las bacterias albergan estas enzimas potencialmente destructivas. Los RE son parte de un sistema de defensa bacteriana contra ADN extraño, como un bacteriófago infeccioso. Los sitios RE en el propio ADN de la bacteria están protegidos de la escisión porque han sido modificados por una metiltransferasa que modifica específicamente los sitios RE. Las actividades combinadas de la endonucleasa y la metiltransferasa se denominan sistema de restricción/modificación. Hoy en día, la mayoría de los RE disponibles comercialmente no se purifican de sus fuentes naturales. En cambio, los RE generalmente se aíslan de bacterias que sobreexpresan grandes cantidades de RE a partir de plásmidos. Estos RE recombinantes a menudo han sido diseñados por biólogos moleculares para incluir cambios de aminoácidos que aumentan la actividad catalítica o la estabilidad del RE.

    Para entender cómo funcionan las RE, utilizaremos EcoRI, una de las RE mejor estudiadas, como ejemplo. Aunque los nombres de los RE individuales pueden sonar un poco como baby talk, la nomenclatura es en realidad muy sistemática y se basa en su fuente biológica. EcoRI se encuentra naturalmente en la cepa RY13 de Escherichia coli. Su nombre comienza con el género y la especie (Eco para E. coli), seguido de un identificador de cepa (R para RY13), y termina con un número romano que distingue los diferentes RE encontrados en la cepa. La cepa RY13 de E. coli contiene múltiples RE, pero solo EcoRI y EcoRV, son ampliamente utilizadas en biología molecular.

    Las enzimas de restricción escinden sitios específicos en el ADN

    Las enzimas de restricción como EcoRI son frecuentemente llamadas 6-cortadoras, ya que reconocen una secuencia de 6 nucleótidos. Suponiendo una distribución aleatoria de A, C, G y Ts en el ADN, la probabilidad predice que un sitio de reconocimiento para un cortador de 6 debe ocurrir aproximadamente una vez por cada 4096 pb (4 6) en el ADN. Por supuesto, la distribución de nucleótidos en el ADN no es aleatoria, por lo que los tamaños reales de los fragmentos de ADN producidos por EcoRI varían de cientos a muchos miles de pares de bases, pero el tamaño medio es cercano a 4000 pb. Los fragmentos de ADN de esta longitud son útiles en el laboratorio, ya que son lo suficientemente largos como para contener la secuencia codificante de proteínas y están bien resueltos en geles de agarosa.

    EcoRI reconoce la secuencia G A A T T C en ADN bicatenario. Esta secuencia de reconocimiento es un palíndromo con un doble eje de simetría, ya que la lectura de 5' a 3' en cualquiera de las cadenas de la hélice da la misma secuencia. La naturaleza palindrómica del sitio de restricción es más evidente en la siguiente figura. El punto en el centro del sitio de restricción denota el eje de simetría. EcoRI cataliza la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster entre G y A en ambas cadenas de ADN. Los fragmentos de restricción generados en la reacción tienen colas cortas monocatenarias en los extremos 5'. Estos extremos a menudo se denominan “extremos pegajosos”, debido a su capacidad para formar enlaces de hidrógeno con secuencias de ADN complementarias.

    Los RE a veces se denominan tijeras moleculares debido a su capacidad para generar fragmentos de restricción que terminan con secuencias definidas. Estos “extremos pegajosos” son importantes para la tecnología de ADN recombinante, ya que permiten a los investigadores construir moléculas de ADN de diseño. Dos moléculas de ADN cualesquiera con extremos pegajosos compatibles pueden unirse entre sí por ADN ligasas que sirven como la “pasta” al volver a sellar los enlaces fosfodiéster rotos. No vamos a estar generando moléculas recombinantes en esta clase, pero es importante entender su importancia para la biología moderna. Considere los plásmidos pBG1805 y pYES2.1. A partir de los mapas plasmídicos del Capítulo 10, se puede ver que estos plásmidos complejos se construyeron uniendo secuencias de ADN de distintas fuentes evolutivas.


    This page titled 11.1: Endonucleasas de restricción is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.