11.2: Las moléculas de ADN tienen mapas de restricción únicos

La secuencia de una molécula de ADN determina la distribución de sitios de reconocimiento para RE. Se han descrito cientos de RE con especifidades únicas, por lo que los investigadores pueden utilizar la distribución de estos sitios de reconocimiento en una molécula de ADN para construir un “mapa” de la secuencia. En estos experimentos, las muestras de ADN se digieren con diversos RE para producir un mapa de restricción, una colección de fragmentos de restricción más pequeños que han sido escindidos en cada extremo por el RE. Las moléculas en el digesto son luego separadas por electroforesis en gel de agarosa (Capítulo 8). A partir de los tamaños de los fragmentos de restricción que se resuelven en el gel, los investigadores son capaces de identificar la molécula de ADN original utilizada en la digestión de restricción.

Se requiere una planificación cuidadosa para mapas de restricción significativos. El primer paso en un experimento de mapeo es identificar los tamaños de fragmentos de restricción que se generarán a partir de una molécula de ADN diana con diferentes RE. Una variedad de programas de software generan estos mapas de restricción y proporcionan datos tabulares con detalles sobre las longitudes y posiciones de los fragmentos de restricción en la secuencia de ADN. La lista de enzimas que cortan una secuencia en particular siempre es impresionante,
pero solo unas pocas enzimas suelen resultar prácticas para los fines del experimento. Al elegir RE para un mapa de restricción, hay muchas cosas a considerar:

• ¿Cuántos fragmentos de restricción se generarán?
• ¿Cuáles son los tamaños previstos de los fragmentos de restricción?
• ¿Se resolverán claramente todos los fragmentos de restricción en geles de agarosa al 1%?
• ¿El RE generará un conjunto distintivo de fragmentos de cada muestra de ADN?
• ¿Qué tan caro es el RE?

En este laboratorio, utilizará el programa NEB Cutter para identificar sitios RE en secuencias plasmídicas. (NEB Cutter es proporcionado por New England Biolabs, un proveedor comercial de RE.)
Recordará que los plásmidos son círculos superenrollados. La digestión con un RE abre un plásmido y relaja su estructura. (Sin digestión con RE, los tamaños aparentes de plásmidos en geles de agarosa no son confiables). Los plásmidos que estamos utilizando para nuestros experimentos son plásmidos complejos basados en pYES2.1 (5886 pb). Busque los resultados de RE que generarán fragmentos de restricción claramente distinguibles de sus plásmidos. ¡Es muy recomendable que selecciones el mismo RE para los tres digestos! Dado que los plásmidos se basan en pYES2.1, no sería sorprendente observar algunos fragmentos de restricción comunes en esos digestos.

Manejo de endonucleasas de restricción en el laboratorio

Los RE que estamos usando en el laboratorio son altamente purificados (¡y caros!) proteínas que han sido purificadas a partir de bacterias recombinantes. Como todas las enzimas, cada RE funciona de manera óptima bajo un conjunto definido de condiciones de reacción, incluyendo temperatura, pH y las concentraciones de iones metálicos y sales. El fabricante de nuestros RE ha desarrollado tampones que soportan altos niveles de actividad para más de 200 RE. Cada tampón contiene 0.1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), una proteína abundante del suero de vaca, que ayuda a estabilizar los RE propensos a la desnaturalización y a prevenir la absorción inespecífica de RE en tubos de ensayo y puntas.

Como todas las enzimas, los RE están sujetos a desnaturalización espontánea, por lo que los RE deben manejarse con cuidado. (En comparación, el ADN es una molécula excepcionalmente estable). La tasa de desnaturación de proteínas aumenta con la temperatura y en las interfaces aire/agua. Algunas precauciones simples minimizarán la desnaturalización. Siga estas sencillas reglas cuando prepare los compendios de restricción:

• Utilice el búfer recomendado para un RE en particular.
• Mantener las reacciones en hielo hasta que comience la incubación.
• Tenga cuidado de no introducir burbujas. No utilice el mezclador vorticial.
• Añadir el RE por último, después de que los demás componentes de la mezcla de reacción hayan sido ensamblados.