Saltar al contenido principal
Library homepage
 
LibreTexts Español

11.4: Ejercicio 2 - Configurar los digestos de restricción

  • Page ID
    53541
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    Las concentraciones de RE y ADN plasmídico necesitan ser emparejadas en una digestión de restricción. Los fabricantes ensayan la actividad de cada lote de RE y expresan la actividad en unidades de actividad enzimática por μL. Se evalúa una unidad de actividad (U) en un ensayo estandarizado para medir las concentraciones de RE. Las digestiones de restricción generalmente se configuran para contener al menos 2-5 U por μg de ADN plasmídico. Los kits ZyppyTM producen típicamente concentraciones plasmídicas que van de 10 a 30 ng/μL. (Podrá estimar sus concentraciones de ADN plasmídico cuando ejecute los geles de agarosa en el siguiente laboratorio). En este laboratorio, estamos usando 7 μL de ADN plasmídico miniprep en cada reacción y 1 U de RE. Esto debería ser más que suficiente RE para asegurar la digestión completa del ADN plasmídico.

    En su cuaderno de laboratorio, anote qué RE (es) ha decidido usar.

    • Prepara un tubo separado para cada uno de tus digestiones RE.
    • Combine los siguientes componentes en cada tubo en el orden indicado:

      7.0 μL de plásmido

      1.0 μL 10X de búfer CutSmart TM o 10X Buffer 3.1 (solo para digestiones HinciI)

      2.0 μL (1.0 U) de enzima de restricción

    El volumen total de reacción debe ser de 10 μL.

    • Asegurar que los componentes de cada reacción estén bien mezclados en el fondo del tubo centrifugándolos por unos segundos en la microcentrífuga.
    • Incubar las muestras a 37 °C durante al menos 2 hr.
    • Guarde las reacciones en el congelador.
    Nota

    El ejercicio 3 se realizará en la próxima sesión de laboratorio.


    This page titled 11.4: Ejercicio 2 - Configurar los digestos de restricción is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.