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11.5: Ejercicio 3 - Analizar las digestiones de restricción en geles de agarosa

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    1. Planifica tu gel. Cada grupo de alumnos preparará un gel de agarosa con 8 carriles de muestra.
    • Cada estudiante recorrerá un carril con plásmido no digerido y un segundo carril con plásmido que ha sido digerido con RE. Es importante correr un carril con plásmido no digerido para determinar si los RE han escindido eficazmente los plásmidos. Tenga en cuenta que los plásmidos no digeridos se electroforzarán con tamaños anómalos debido a sus estructuras superenrolladas.
    • Un carril debe reservarse para los patrones de peso molecular.
    • Graba en tu libreta cómo planeas cargar tu gel.

    2. Preparar un gel de agarosa al 1% en tampón TAE como se describe en el Capítulo 8.

    3. Preparar las muestras para electroforesis. Use todo el digerido de restricción en el gel. Para muestras de plásmidos no digeridos, instale tubos que contengan 7 μL de plásmido y 3 μL de agua desionizada.

    IMPORTANTE: Devuelva cualquier plásmido no utilizado al congelador. Utilizará los plásmidos para la transformación de levaduras en un laboratorio posterior.

    Combinar:

    10 μL de digestión de restricción o plásmido no digerido

    5 μL de agua desionizada

    3 μL 6X tampón de muestra

    4. Cargar y ejecutar el gel de agarosa como se describe en el Capítulo 8.

    5. Estime las concentraciones de ADN en sus preparaciones plasmídicas. Después de que el gel haya sido corrido y teñido, intente estimar las concentraciones de ADN en sus tres preparaciones plasmídicas, utilizando los estándares de tamaño como referencia. Cada uno de los marcadores, con la excepción del marcador de 3 kb, contiene ~40 ng. La banda de 3 kb contiene 125 ng. Usa estos valores para estimar visualmente la cantidad de ADN en tu carril. Correcto para el volumen de muestra en el carril para calcular la concentración de ADN en cada preparación de plásmido. (Aunque impreciso, este valor será útil para calcular su eficiencia de transformación en el próximo laboratorio).


    This page titled 11.5: Ejercicio 3 - Analizar las digestiones de restricción en geles de agarosa is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.