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12.1: La transformación altera el fenotipo de una célula

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    La transformación se refiere a la captación de ADN por una célula, provocando un cambio en su fenotipo. La transformación natural fue descrita por primera vez en 1928 por Frederick Griffith, quien describió un principio de transformación termoestable a partir de Streptococcus pneumoniae virulento que podría transformar S. pneumoniae no virulento a una forma virulenta encapsulada. El principio transformador fue posteriormente identificado como ADN por Avery y colegas en 1944. Desde entonces, la transformación se ha convertido en una herramienta indispensable en el laboratorio de biología molecular. La base física para la transformación de levaduras aún no se entiende completamente, pero los investigadores han desarrollado empíricamente condiciones que dan una transformación bastante consistente en el laboratorio. Se han desarrollado técnicas de transformación confiables para bacterias y muchos eucariotas, que van desde levaduras hasta células de mamíferos.

    Las condiciones de transformación se han desarrollado empíricamente

    El reto en la transformación de laboratorio es idear condiciones bajo las cuales el
    ADN pasará a través de la pared celular y la membrana plasmática de las células vivas, que normalmente son impermeables al ADN. Muy pocas células son naturalmente competentes, o capaces de tomar ADN por sí mismas. En consecuencia, los investigadores utilizan una variedad de tratamientos químicos para hacer que las células sean competentes. En general, estos tratamientos químicos tienen algún tipo de efecto desestabilizador sobre la membrana plasmática. La introducción de ADN en estas células competentes puede ser estimulada aún más por un estrés físico, como un pulso de corriente eléctrica o elevación de temperatura. La transformación no es un proceso muy eficiente, pero debido a que se pueden cultivar grandes cantidades de microorganismos en el laboratorio, se pueden obtener números útiles de transformantes con la mayoría de los microorganismos.

    Las técnicas para la transformación de levaduras son ahora estándar en el laboratorio. Dependiendo de los detalles del procedimiento experimental, las reacciones pueden producir hasta 10 6 transformantes por μg de ADN. La estructura del ADN utilizado para la transformación afecta en gran medida la eficiencia de la transformación. Las eficiencias de transformación son considerablemente mayores con ADN plasmídico superenrollado que con piezas lineales de ADN, posiblemente debido a que los plásmidos ingresan a la célula más fácilmente y/o los plásmidos son menos susceptibles a la digestión con endonucleasas.

    Los métodos de transformación de levaduras más utilizados utilizan una combinación de acetato de litio, ADN portador monocatenario y polietilenglicol (PEG). Aunque nadie sabe exactamente cómo estos componentes promueven la transformación, se han avanzado una serie de hipótesis. Los iones de litio neutralizan las cargas negativas sobre las moléculas de ADN a transformar y la bicapa fosfolipídica de la célula de levadura, y también pueden generar pequeños agujeros en la membrana plasmática que permiten el paso de ácidos nucleicos. El ADN monocatenario actúa como vehículo para que el ADN plasmídico se transfiera a la célula y puede ayudar a proteger a esta última de las endonucleasas. La fuente del ADN portador no es importante. Dado que la concentración de ADN portador es considerablemente mayor que la del ADN que se va a introducir en la célula,

    el ADN portador generalmente se aísla de una fuente económica, como el esperma de salmón. Es imperativo que el ADN portador para las transformaciones sea monocatenario. En nuestros experimentos, herviremos el ADN portador durante 5 minutos y luego lo enfriaremos rápidamente para evitar el enrollamiento de la hélice del ADN. El PEG puede ayudar a acercar el ADN a una aposición más cercana con la membrana. El PEG se usa a menudo para promover la fusión de membranas y se cree que altera la estructura del agua alrededor de las membranas plasmáticas


    This page titled 12.1: La transformación altera el fenotipo de una célula is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.