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12.3: Consideraciones experimentales

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    Quizás se esté preguntando por qué no estamos utilizando la complementación de genes MET para aislar transformantes, ya que este es el objetivo del proyecto de nuestro semestre. Hay varias razones por las que estamos usando placas Yc-ura, en lugar de placas Yc-Met, para aislar tranformantes. Primero, debemos asegurar que los plásmidos de sobreexpresión hayan transformado satisfactoriamente las cepas de deleción y es posible que las proteínas de fusión Met codificadas por los plásmidos no puedan complementar las deficiencias satisfechas en los transformantes. La complementación del gen URA3 ofrece un medio bien probado y confiable para evaluar la transformación exitosa que es independiente del metabolismo de la metionina.

    Un segundo problema se refiere a las incertidumbres asociadas con la regulación de los ORF plasmídicos
    por el promotor GAL1 (Johnston, 1987). El promotor GAL1 es un promotor inducible que normalmente se reprime cuando las células crecen en glucosa y se induce cuando la galactosa reemplaza a la glucosa como fuente de carbono. En su localización cromosómica normal, el promotor GAL1 responde a una variedad de reguladores de la transcripción positivos y negativos (Capítulo 13). Aunque un gran número de estudios han establecido que el promotor GAL1 funciona bien en localizaciones ectópicas, tales como plásmidos, el promotor no está tan estrechamente regulado en plásmidos como en el cromosoma de levadura. Parte de esta diferencia puede estar relacionada con el número de copia. Se pueden esperar múltiples copias de los plásmidos pYES2.1 en células tranformadas.

    Después del aislamiento de transformantes de placas Yc-ura, analizará la complementación del gen MET en placas Yc-Met que contienen D-glucosa y D-galacatosa. Tenga en cuenta que la galactosa y la glucosa pueden no funcionar como simples interruptores de “ON” y “OFF” porque el equilibrio regulatorio se ve alterado en las células transformadas. Es posible, por ejemplo, que la transcripción génica “permeable” pueda ocurrir en presencia del represor normal, la D-glucosa. En este caso, los genes MET complementarían a los mutantes met cultivados en D-glucosa. También es posible que las células transformadas puedan producir cantidades excesivas de Met y proteínas que son perjudiciales, o incluso fatales, para las células transformadas.


    This page titled 12.3: Consideraciones experimentales is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.