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12.5: Ejercicio 1 - Transformación de levaduras

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    El siguiente protocolo es una ligera modificación del protocolo de transformación “Quick and Dirty” descrito por Amberg et al. (2005). Con una cuidadosa atención al detalle y cepas cooperativas, este procedimiento puede producir miles de transformantes por μg de ADN plasmídico. Las modificaciones a este método pueden incrementar su eficiencia en varios órdenes de magnitud (Gietz y Schiestl, 2007), lo que se requeriría si se utilizaran piezas lineales de ADN para tranformar levaduras.

    Preparar una mezcla maestra de transformación

    1. Prepara una mezcla maestra de transformación. Los siguientes ingredientes proporcionan suficientes reactivos para cinco reacciones de transformación. Combine y mezcle en un tubo de microcentrífuga:

    100 μL estéril 2 M acetato de litio (recién preparado)
    400 μL estéril 50% PEG-3350
    4 μL 2-mercaptoetanol (STINKY!! ¡agrega esto en la campana de humos!)

    Configurar reacciones de transformación individuales - para cada transformación:

    2. Agregar 15 μL del ADN de esperma de salmón desnaturalizado (2 mg/mL) a un nuevo tubo de microcentrífuga etiquetado con el nombre (o código) del plásmido.

    Nota: Es importante que el ADN del esperma de salmón sea monocatenario para que este procedimiento funcione bien. Hervir el ADN durante 5 minutos para desnaturalizar el ADN. Enfríe rápidamente el ADN colocándolo inmediatamente en hielo. Mantenga el ADN en hielo hasta que esté listo para usarlo.

    3. Agregue 5 μL de ADN plasmídico miniprep al tubo de microcentrífuga debidamente etiquetado.

    4. Agregue 100 μL de mezcla de transformación del paso 1 a cada tubo de microcentrífuga. Vortex por 10-15 segundos para mezclar el contenido.

    5. Usando un palillo de dientes estéril o punta de micropipeta, raspe una colonia grande de levadura (o el equivalente de una “cabeza de fósforo” de levadura) de una placa YPD. Transfiera la levadura al tubo de microcentrífuga que contiene la solución de transformación/ADN (paso 4) girando el palillo varias veces. Asegúrese de que las células estén suspendidas uniformemente antes de continuar.

    Repita los pasos 2-5 para cada una de sus reacciones de transformación. Asegúrese de incluir un control que no contenga ADN plasmídico.

    6. Incubar las mezclas de transformación a 37° C con agitación durante 30-45 minutos.

    Colocar las células transformadas en medios selectivos que carecen de uracilo.

    7. Retirar 10 μL de las células resuspendidas y agregarlas a 90 μL de agua estéril en un tubo de microcentrífuga. Esta muestra se diluirá en serie para una placa puntual (paso 9) que utilizará para calcular la eficiencia de la transformación.

    8. Extienda el resto de la mezcla sobre una placa de medios selectivos que carezca de uracilo. Transfiera la reacción de transformación a la placa, y luego sacuda ~4 perlas de vidrio estériles que extenderán las células. Cubra las placas y pase 0.5-1 minutos agitando las placas para que las perlas esparzan la mezcla de transformación uniformemente sobre la superficie de la placa. Deseche las cuentas de vidrio en los contenedores de desechos apropiados, para que puedan esterilizarse y volver a usarse. Incubar las placas a 30° C hasta que se puedan detectar colonias. Lo más temprano que las colonias serán visibles suele ser de 2 días. Si las colonias son pequeñas, permita que crezcan un día adicional (s) a 30° C. Contar el número de colonias en la placa.

    Determinar el número de células viables en la mezcla de transformación.

    9. Preparar una serie de 4 diluciones adicionales de las células reservadas en la etapa 7. Use estas diluciones
    para una placa de manchas en medios YPD. Cada fila en la placa debe contener celdas de una reacción de transformación diferente. Incubar las células a 30° C o temperatura ambiente hasta que se puedan detectar colonias individuales. No permita que la placa crezca demasiado, porque es necesario distinguir colonias individuales.

    Calcular la eficiencia de transformación. La eficiencia de la transformación está influenciada tanto por la calidad del ADN utilizado como por los detalles precisos del procedimiento de transformación.

    10. Calcular la fracción de células que se transformaron como se muestra a continuación. El volumen total de la mezcla de transformación fue de ~120 μL, incluyendo células de levadura. Se utilizaron diez μL para la siembra puntual y los 100 μL restantes se utilizaron para la transformación.

    12-efficiency.jpg

    11. Las eficiencias de transformación generalmente se expresan por el número de células transformadas por μg de ADN. En el último laboratorio (Capítulo 11), analizaste tus preparaciones de plásmidos en geles de agarosa y obtuviste una estimación aproximada de las concentraciones de ADN de tus preparaciones de plásmido. Tenga en cuenta que analizó 7 μL de plásmido prep en esos geles. En este laboratorio de transformación, utilizó 5 μL de sus preps plasmídicos.

    Calcular la eficiencia de transformación:

    A. Multiplique ese número de células transformadas en la placa YC por 1.1
    (solo se sembraron 100 de 110 μL en la reacción de transformación).

    B. Convierte el ng del plásmido en tu reacción de transformación a μg.

    C. Divide el valor calculado en A por el de B.


    This page titled 12.5: Ejercicio 1 - Transformación de levaduras is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.