Saltar al contenido principal
Library homepage
 
LibreTexts Español

13.2: Preparación de extractos proteicos a partir de células de levadura

  • Page ID
    54143
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    Las proteínas comprenden aproximadamente la mitad del peso seco de la mayoría de las células e incluyen las muchas proteínas estructurales, catalizadores, receptores y proteínas de señalización responsables de la función celular. Para entender la función celular, los científicos a menudo quieren analizar la composición proteica de las células. El análisis de proteínas comienza con la preparación de un extracto celular, idealmente en condiciones que minimizan la degradación proteica. Preparar buenos extractos celulares es una especie de arte, y muchos factores necesitan ser considerados durante el diseño de un protocolo de extracción.

    En este curso, estaremos analizando la función proteica en levadura. Una célula de levadura haploide promedio contiene ~6 pg de proteína (Sherman, 2002). Aunque las células de levadura tienen muchas ventajas para los estudios genéticos, son notoriamente difíciles de usar para estudios bioquímicos. Sin embargo, los científicos han podido desarrollar procedimientos para extraer proteínas de levadura que eluden estas barreras experimentales.

    La primera consideración en el diseño de un procedimiento de extracción es la compartimentación de las células. Todas las células están rodeadas por una membrana plasmática y las células eucariotas contienen membranas adicionales que rodean orgánulos. Las células fúngicas también tienen paredes celulares a base de celulosa que protegen a las células contra las fuerzas mecánicas y osmóticas. Los procedimientos de extracción celular comienzan con la alteración de la membrana plasmática y la pared celular por tratamientos mecánicos y/o químicos. La alteración mecánica de las células de levadura debe ser bastante vigorosa porque sus paredes celulares son muy duras. Los métodos mecánicos comúnmente utilizados para interrumpir la levadura incluyen sonicación, alta presión y “batido” con perlas de vidrio. Estos tratamientos vigorosos corren el riesgo de dañar las proteínas debido al calor y la formación de espuma que se generan durante los procesos.

    Los tratamientos químicos ofrecen una alternativa más suave a la interrupción mecánica para la preparación de extractos. Los procedimientos de extracción química frecuentemente incluyen detergentes que solubilizan los lípidos de membrana, permitiendo así que las proteínas se difundan fuera de la célula. La mayoría de los detergentes no discriminan entre membranas intracelulares y plasmáticas, por lo que un extracto detergente generalmente contiene proteínas de múltiples orgánulos así como proteínas citoplásmicas. En este experimento, utilizaremos dodecilsulfato de sodio (SDS) como detergente. El SDS es un detergente desnaturalizante que despliega las estructuras proteicas al romper los miles de enlaces débiles que normalmente estabilizan las estructuras proteicas. Las proteínas se convierten en bobinas aleatorias recubiertas a lo largo de sus longitudes por moléculas SDS cargadas negativamente.

    Al preparar extractos, se debe tener cuidado para proteger las proteínas de la degradación por proteasas celulares. Las células contienen proteasas con muchas especificidades diferentes que son responsables del recambio normal de las proteínas en las células. La disrupción celular a menudo libera proteasas de compartimentos como los lisosomas, proporcionándoles acceso a proteínas citoplásmicas. Las levaduras son notoriamente ricas en proteasas. En una célula de levadura intacta, muchas de estas proteasas se encuentran en la vacuola de levadura, la cual es análoga al lisosoma de mamífero. El protocolo que utilizaremos en este curso (Amberg
    et al. , 2005) utiliza una combinación de calor y SDS para destruir rápidamente las proteasas de levadura. Las suspensiones celulares se sumergen inmediatamente en un baño de agua hirviendo después de la adición de SDS. Los extractos preparados por este método son adecuados para electroforesis y análisis de transferencia Western.


    This page titled 13.2: Preparación de extractos proteicos a partir de células de levadura is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.