Saltar al contenido principal
Library homepage
 
LibreTexts Español

15.5: Ejercicio 1 - Preparación de la réplica de membrana

  • Page ID
    53659
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)\(\newcommand{\AA}{\unicode[.8,0]{x212B}}\)

    Separar las proteínas en un gel SDS-PAGE

    1. Separar las proteínas que serán analizadas en transferencias Western por SDS-PAGE.

    1. Retire el aparato de electrodos y el soporte del tanque, y retire el gel del soporte. No retire el gel de las placas hasta que esté listo para ensamblar el casete de transferencia (ver más abajo).
    2. Deseche el búfer restante por el fregadero. Enjuague el tanque de amortiguación con agua desionizada para eliminar el SDS residual, lo que puede interferir con el proceso de transferencia.

    Prepara la membrana de transferencia
    NOTA: NO toque las membranas de transferencia con los dedos. Use guantes y fórceps de filtro cuando maneje membranas de transferencia.

    1. Reúne la membrana PVDF y dos trozos de papel de filtro grueso, como Whatman 3MM TM. La membrana PVDF y los papeles de filtro deben cortarse a un tamaño ligeramente mayor que el gel SDS-PAGE. También necesitará un casete de transferencia y dos almohadillas de fibra.

    1. Preparar la membrana PVDF. Con lápiz, coloque una marca de orientación en una esquina de la membrana PVDF para su posterior identificación. Moje la membrana colocándola en una pequeña bandeja que contiene metanol durante ~30-60 segundos con agitación suave.
    2. Deseche el metanol en el contenedor de desechos y agregue agua desionizada a la bandeja. Agitar suavemente durante ~1 minuto.
    3. Reemplace el agua desionizada con tampón de transferencia. Guarde la membrana en tampón de transferencia hasta que esté listo para comenzar la transferencia.

    Ensamble el casete de transferencia

    1. Usando una espátula o una cuña de plástico verde, retire la pequeña placa de vidrio del gel. El gel permanecerá unido a la gran placa de vidrio. Con una espátula, retire la esquina inferior derecha del gel para que sirva como marca de orientación. (Esto se traslada al primer carril de tu gel.)

    2. Ensamble el casete de transferencia como se muestra a continuación. Asegúrese de que todas las partes del “sándwich” de transferencia permanezcan húmedas en todo momento.

    Screen-shot-2016-04-25-at-3.33.27-pm.png

    • Coloque una almohadilla de fibra húmeda (2) en la parte superior de la cara negra del casete (1).
    • Agrega dos trozos de papel de filtro (3,4).
    • Coloca el gel (5) encima del papel de filtro mientras aún está adherido a la placa de vidrio. Usa una espátula para liberar cuidadosamente el gel del plato. Es posible que le resulte más fácil eliminar el gel comenzando por el borde inferior cerca del frente del tinte.
    • Colocar la membrana PVDF (6) encima del gel. Orientar el gel para que la marca de lápiz en la membrana corresponda a la esquina recortada del gel. Asegúrese de que NO haya burbujas de aire entre el gel y la membrana.
    • Añadir los papeles de filtro restantes (7,8) y la almohadilla de fibra (9).
    • Doble la cara transparente del casete (10) sobre el conjunto de gel y deslice cuidadosamente la abrazadera en su lugar.

    Transferencia electroforética de proteínas

    1. Coloque el sándwich de transferencia en el soporte del casete con la cara negra del casete de transferencia alineada con el lado negro del soporte del casete y la cara transparente alineada con el lado rojo del soporte del casete (derecha). NOTA: Cada soporte de cassette puede contener dos casetes de transferencia.
    2. Coloque el portacasetes y los casetes ensamblados en el tanque de electroforesis. Agrega una bolsa de hielo al tanque. Screen Shot 2019-01-04 a las 9.21.07 PM.png
    3. Llene el tanque de electroforesis hasta la parte superior con tampón de transferencia.
    4. Coloque la tapa en el tanque alineando negro con negro y rojo con rojo.
    5. Transferir las proteínas a 100 V durante 1 hora a temperatura ambiente o a 20 V durante la noche en la cámara fría. Si va a transferir durante la noche, asegúrese de etiquetar el tanque con claridad y coordinar las actividades del día siguiente con otras personas que compartan el tanque con usted.
    6. Cuando la transferencia esté completa, retire el casete de transferencia del tanque. Vuelva a verter el tampón de transferencia en su botella original para que pueda ser reutilizado.
    7. Desmonte el casete de transferencia. Dependiendo de su horario:
    • Si va a continuar con el procedimiento western, omita el paso de rehidratación (paso 1) a continuación y continúe con el paso de bloqueo (paso 2). ¡Ten cuidado de que la membrana permanezca húmeda!
    • Si va a procesar la membrana en un momento posterior, deje que la membrana se seque. Envuelva la membrana en una envoltura de plástico y guárdela para un período posterior de laboratorio.

    This page titled 15.5: Ejercicio 1 - Preparación de la réplica de membrana is shared under a CC BY-NC-SA license and was authored, remixed, and/or curated by Clare M. O’Connor.