6.5: Bioquímica de los aminoácidos de azufre

S. cerevisiae requiere tres aminoácidos que contienen azufre para vivir. Además de Met
y Cys, que se incorporan a las proteínas celulares, las células también requieren S-adenosilmetionina (AdoMet), que suministra grupos metilo activados para muchas reacciones de metilación. La visión consensuada de la síntesis de estos tres aminoácidos en la página anterior está ahora bien respaldada por la evidencia bioquímica y genética de muchos laboratorios (revisado en Thomas
& Surdin-Kerjan, 1992). Las relaciones geno-enzima no pudieron establecerse definitivamente hasta el desarrollo de técnicas de clonación molecular y secuenciación de ADN, lo que permitió a los investigadores utilizar la complementación plasmídica para probar la función génica directamente. En estos experimentos, los investigadores construyeron plásmidos con genes MET, CYS o SAM de tipo silvestre, los cuales fueron transformados en cepas mutantes. Las cepas transformadas solo pudieron sobrevivir cuando el plásmido contenía el alelo de tipo silvestre del gen inactivado en el mutante. (Utilizará la complementación plasmídica en esta clase para confirmar la identificación de sus cepas y plásmidos).

La mayoría de los genes con los que trabajaremos este semestre codifican enzimas que catalizan una interconversión de una molécula que contiene azufre en una segunda molécula que contiene azufre. Otros genes MET codifican enzimas que no participan directamente en la síntesis de aminoácidos de azufre, sino que catalizan la síntesis de un cofactor o un donante de metilo requerido para la síntesis de aminoácidos de azufre. En la breve descripción a continuación, seguiremos el avance de un átomo de azufre a partir de sulfato inorgánico a través de su conversión a Met, Cys o AdoMet.

La asimilación de sulfato implica activación de azufre y reducción a sulfuro

Los primeros pasos de la vía, que abarca las reacciones involucradas en la conversión de sulfato en sulfuro, comprenden la vía de asimilación de sulfato. Los iones sulfato son la fuente de mayor cantidad de azufre en las moléculas biológicas, pero se requiere considerable energía metabólica para activar el sulfato desde su estado de oxidación +6 y convertirlo en sulfuro, que tiene un estado de oxidación -2. Las enzimas responsables de la asimilación del sulfato están ampliamente distribuidas en microorganismos y plantas. En S. cerevisiae, el sulfato se activa primero por ATP sulfurilasa, o Met3P, para formar 5'-adenilsulfato (APS). A continuación, el APS es fosforilado por Met14P, o APS quinasa, formando 3'-fosfo-5'-adenilsulfato (PAPS). PAPS es una molécula interesante, ya que contiene un átomo de azufre activado que puede ser utilizado para una variedad de reacciones de transferencia de azufre. En mamíferos, el PAPS se usa para una variedad de reacciones de sulfatación en el Golgi, donde los aceptores incluyen lípidos, proteínas y una variedad de moléculas pequeñas. (Curiosamente, la quinasa APS es la única enzima de levadura involucrada en la asimilación de sulfato con homologos en mamíferos).

Los dos últimos pasos en la asimilación de sulfato son reacciones de reducción dependientes de NADPH. PAPS reductasa, o Met16P, cataliza la primera reacción, que agrega dos electrones al átomo de azufre. La reducción final de 6 electrones es catalizada por sulfito reductasa. La sulfito reductasa es una metaloenzima compleja que contiene dos subunidades Met5p y dos Met10p, así como múltiples grupos protésicos, incluyendo sirohemo, que participan en la transferencia de electrones. (Un grupo protésico es un ion metálico o molécula orgánica que se une covalentemente a una enzima y es esencial para su actividad). En levaduras, el sirohemo se sintetiza en una serie de reacciones catalizadas por Met1p y Met8p. La síntesis de sirohemo no se considera formalmente como parte de la vía de asimilación del sulfato, pero su función es crítica para el ensamblaje de sulfito reductasa funcional.

Síntesis de homocisteína y transsulfuración

En el siguiente paso de la biosíntesis de Met y Cys, el sulfuro se incorpora al aminoácido homocisteína (Hcy). Hcy se encuentra en el punto de ramificación entre varias vías en la levadura. La cadena principal de aminoácidos de Hcy deriva finalmente del ácido aspártico, que se ha convertido en
una serie de etapas en homoserina. (Nota: Los aminoácidos “homo” tienen un átomo de carbono extra en sus cadenas laterales en comparación con los homónimos sin el prefijo). Met2p activa la homoserina
en una reacción de acetilación que utiliza acetil-CoA. Met17p, también conocido como homocisteína sintasa o O-acetil homoserina sulfhidriasa, luego cataliza la reacción de O-acetilhomoserina con sulfuro para formar Hcy.

En la levadura, Hcy sirve como precursor para Cys o Met. La vía que conecta Hcy y Cys se conoce como la vía de transsulfuración. La transsulfuración proporciona a S. cerevisiae una flexibilidad inusual con respecto a las fuentes de azufre. Cuatro productos génicos diferentes están involucrados en la conversión de Hcy a Cys y viceversa, utilizando cistationina (abajo) como intermedio común. Str2p cataliza la síntesis de cistationina a partir de Cys y O-acetilhomoserina, el producto de la reacción catalizada por Met2p. En la vía opuesta, Cys4p (también conocido como Str4p) cataliza la síntesis de cistationina a partir de Hcy y Ser. Los cuatro genes en la ruta de transferencia de azufre muestran diferentes patrones de conservación evolutiva. Por ejemplo, E. coli es incapaz de sintetizar Cys a partir de Met, mientras que los mamíferos son incapaces de sintetizar Met a partir de Cys.

La cistationina es el intermedio para las reacciones de transsulfuración. Las enzimas en la vía de transsulfuración de S. cerevisiae son codificadas por los genes STR1 - STR4. STR2py STR1p (Cys3p) catalizan la síntesis e hidrólisis, respectivamente, del enlace cistationina S-C _g. Str3p y Str4p (Cys4p) catalizan la síntesis e hidrólisis, respectivamente, del enlace cistationina S-C _b.

La metionina y AdoMet se forman durante el ciclo del metilo

Hcy es también el punto de partida de un ciclo que produce Met y AdoMet. El ciclo comienza cuando Met6p cataliza la conversión de Hcy a Met, utilizando un donador de metilo inusual, poliglutamil 5-metil-tetrahidrofolato (THF). Los genes MET13 y MET7 codifican las enzimas que catalizan los dos últimos pasos en la síntesis de poliglutamil 5-metil-THF, lo que explica su incapacidad de las células met7 y met13 para sintetizar metionina.

Como cabría esperar, la mayor parte de la metionina se usa para la síntesis de proteínas en las células, pero una cantidad apreciable es convertida en el donante de metilo de alta energía, AdoMet, por dos AdoMet sintasas casi idénticas, Sam1p y Sam2p. S. cerevisiae es capaz de sintetizar grandes cantidades de AdoMet, el cual se usa para reacciones de transmetilación o se almacena en su vacuola. (De hecho, la levadura es la fuente de la mayoría de AdoMet de producción comercial). Múltiples metiltranferasas de levadura catalizan la transferencia de grupos metilo de AdoMet a cientos de sustratos diferentes, que incluyen bases nucleotídicas y azúcares en ADN y ARN, varias cadenas laterales de aminoácidos en proteínas, lípidos, moléculas pequeñas y más. Cada reacción de transmetilación genera una molécula de S-adenosilhomocisteína (AdoHcy), la cual es hidrolizada a adenosina y Hcy por SaH1p, completando el ciclo de metilo.

No vamos a estudiar las enzimas involucradas en el ciclo del metilo en esta clase, pero
es importante apreciar su importancia para la supervivencia celular. Las secuencias de aminoácidos de Sam1p y Sam2p son 93% idénticas, lo que es mucho mayor que otras proteínas que han surgido por duplicación génica en S. cerevisiae. Esta redundancia proporciona un búfer contra la pérdida de cualquiera de las funciones. Las células con una mutación en el gen SAM1 o SAM2 son capaces de sobrevivir, pero las células con mutaciones en ambos genes son incapaces de sobrevivir. De manera similar, el gen SAH1 es uno de los pocos genes esenciales en S. cerevisiae, probablemente porque la acumulación de ADOhcy inhibiría muchas reacciones de metiltransferasa.

Las mutaciones interrumpen las

Los mutantes met que estás analizando son incapaces de catalizar una de las reacciones requeridas para la síntesis de aminoácidos de azufre. En este laboratorio, utilizará medios selectivos y diferenciales para determinar qué genes han sido inactivados en sus cepas. Piense en cada mutación como borrar una de las flechas que se muestran en la ruta de aminoácidos de azufre. Nuestros medios selectivos contienen una variedad de fuentes de azufre. Dependiendo de la posición de la mutación met con respecto a la fuente de azufre, la cepa puede o no ser capaz de sintetizar los aminoácidos de azufre.

También se utilizará el medio diferencial, agar BigGy para distinguir las cepas de levadura
por la cantidad de sulfuro de hidrógeno que producen. Esto se debe a que BigGy contiene bismuto, que reacciona con sulfuro para formar un precipitado pardusco a negro. Se espera que todas las cepas crezcan en BigGy, ya que contiene extracto de levadura, que es fuente de metionina. BigGy también contiene sulfito, en lugar de sulfato, como fuente primaria de azufre. Localice las posiciones de sus genes mutados en la ruta relativa al sulfuro y al sulfito. Las mutaciones en genes aguas arriba del sulfuro deben producir colonias más ligeras, ya que se producirá menos sulfuro. De estas, las mutaciones que impiden la reducción de sulfito deberían producir las colonias más ligeras. Las mutaciones en genes aguas abajo del sulfuro deberían producir colonias más oscuras, ya que las cepas serán incapaces de metabolizar el sulfuro.

Al hacer sus predicciones para este experimento, puede encontrar útil esta analogía: Una vía metabólica no es diferente a una autopista unidireccional (debido a consideraciones energéticas, la mayoría de las vías metabólicas son unidireccionales) con una serie de puentes que conectan islas. (Las islas tienen diferentes niveles de energía. ) Los autos que pasan por la carretera son las moléculas que se están convirtiendo de una forma a otra. Cuando un automóvil llega a la siguiente isla en el camino, su color cambia porque se ha convertido en una molécula diferente. Los puentes son las enzimas
en la vía. Facilitan el paso de los autos, porque catalizan las reacciones que convierten una molécula a la siguiente. Si se produce una mutación en un gen que codifica una enzima en particular, ese puente en particular se cae. Los autos comienzan a acumularse antes del puente roto, y muy pocos autos se encontrarían en las islas más allá del puente roto. En algunos casos, puede haber una ruta alternativa, o vía de salvamento, pero esta suele ser una ruta menos eficiente.