13: Sobreexpresión de proteínas

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En este laboratorio, utilizará diversas fuentes de carbono para manipular la expresión de proteínas de fusión Met y LacZ en
células que han sido transformadas por plásmidos de sobreexpresión. El factor de transcripción Gal4p (arriba) se une
al promotor GAL1 en los plásmidos y controla la expresión de proteínas. En este laboratorio, preparará
extractos de proteínas de células que crecen en condiciones tanto reprimidas como inducidas para su posterior análisis.

Objetivos

Al finalizar este laboratorio, los alumnos podrán

Comparar los efectos de diferentes fuentes de carbono sobre la transcripción de genes controlados por el promotor GAL1 de levadura.
Explicar los papeles del calor y los detergentes en la preparación de extractos celulares de levadura.
Cultivar levaduras con diferentes fuentes de carbono para inducir o reprimir la expresión del promotor GAL1.
Preparar extractos de cepas de levadura transformadas adecuadas para su uso en geles SDS-PAGE y Western blots.

Durante las próximas semanas, estarás analizando la expresión de S. pombe y S. cerevisiae Met o proteínas de fusión lacZ bacterianas en tus cepas transformadas. Ya has probado la capacidad de los plásmidos de sobreexpresión para complementar la mutación met en tus cepas de levadura. La complementación depende de la presencia de proteínas Met funcionales. Si observaste una falla en complementar la deficiencia de met, esto podría indicar que las proteínas no se expresaron a partir de los plásmidos. Alternativamente, las proteínas sobreexpresadas pueden estar presentes, pero no funcionar normalmente. Recuerde que las proteínas expresadas a partir de los plásmidos BG1805 y pYES2.1 son proteínas de fusión con secuencias adicionales en sus extremos C (Gelperin et al. , 2005). Las actividades bioquímicas de estas proteínas de fusión no han sido evaluadas previamente. (¡Somos los primeros en probar si las proteínas de fusión Met funcionan de manera similar a las proteínas normales de S. cerevisiae!)

En este experimento, prepararás extractos de levadura para experimentos posteriores (Capítulos 14 y 15) en los que determinarás si las proteínas de fusión Met y LacZ se están expresando con éxito en las cepas de levadura transformadas y cómo la expresión de las proteínas de fusión varía con las fuentes de carbono.