14.2: Fundición de geles SDS-PAGE

Estas instrucciones están diseñadas para construir dos geles SDS-PAGE 12% con el sistema BioRad Mini Protean. Se utilizará un gel para la tinción Simply Blue en el siguiente laboratorio. El segundo gel se utilizará para la transferencia western.

Ensamble el aparato de colada de gel

1. Ensamble los componentes que necesitará para fundir el gel: una placa de vidrio alta con espaciadores de 1 mm unidos, una placa de vidrio pequeña, un marco de fundición verde y un soporte de fundición.
2. Coloque el marco de fundición verde en el banco con los “pies” verdes apoyados firmemente contra el banco y las abrazaderas abiertas (perpendiculares al marco) y mirando hacia usted.
3. Coloque las dos placas de gel en el marco. Inserte la placa espaciadora más alta con las flechas “ARRIBA” hacia arriba y los espaciadores orientados hacia usted en el marco de fundición (el logotipo de BioRad debería estar orientado hacia usted). Inserte la placa de vidrio corta en la parte delantera del marco de fundición. Debe haber un espacio entre las placas.
4. Asegure las placas en el marco de fundición empujando las dos compuertas del marco hacia los lados. IMPORTANTE: los bordes inferiores de las dos placas deben estar al ras con la mesa de laboratorio antes de cerrar el marco para asegurar un sello hermético. Para ello, apoye el marco verticalmente en la banqueta ANTES de cerrar las compuertas.
5. Sujete el marco de fundición con placas de vidrio en el soporte de fundición, con las compuertas del marco de fundición hacia usted. Repita los pasos 1-5 para preparar un segundo gel en el marco de colada.
6. Verifique si las placas ensambladas en el soporte de fundición están selladas correctamente pipeteando una pequeña cantidad de agua desionizada en el espacio entre las placas. Si las placas de vidrio retienen agua y no tienen fugas, usted está listo para hacer los geles. Vierta el agua sujetando toda la plataforma de fundición sobre un recipiente o fregadero de desechos líquidos. Use toallas de papel o pañuelos de papel para absorber cualquier agua residual. Si el gel tiene fugas, desmonte el marco, seque las placas y vuelva al paso 3.

Prepara dos geles de resolución.

Los monómeros de acrilamida y bisacrylamida son neurotoxinas débiles. Se deben usar guantes y gafas cuando se trabaja con acrilamida.

Arme los químicos que necesitará para verter los geles. La siguiente tabla muestra las cantidades de cada químico que necesitarás para verter dos geles con el sistema Mini-Protean. La polimerización ocurre rápidamente, así que asegúrese de seguir las instrucciones paso a paso a continuación.

Nota

Los catalizadores NO deben incluirse en la mezcla hasta que esté listo para verter los geles!!

1. Etiquetar dos tubos cónicos de 15 mL “Gel Resolver” y “Gel apilable”.
2. Prepara SOLO los geles de resolución en este momento. Mezclar la solución de acrilamida, tampón Tris pH 8.8 y agua, como se muestra en la tabla anterior. Mezclar los ingredientes suavemente, tratando de no introducir aire. El oxígeno inhibe la polimerización de geles de acrilamida.
3. A la mezcla de gel resolutivo, agregar 100 μL de una solución de persulfato amónico (APS) al 10%. Mezcle gentilmente la solución, tratando de no introducir aire. El oxígeno inhibe la polimerización de acrilamida.
4. Agregar 10 μL de catalizador TEMED. Una vez más, mezcle suavemente el catalizador tratando de no introducir burbujas de aire. PRECAUCIÓN: TEMED tiene un olor desagradable. Cubra el tubo inmediatamente después de tomar una alícuota de este reactivo.
5. Trabajando rápidamente, use una pipeta de transferencia de plástico para llenar el espacio entre las dos placas hasta que la solución de gel de resolución alcance una altura justo por encima de las abrazaderas verdes en el marco de fundición de gel. Extraer cualquier acrilamida restante en la pipeta de transferencia. (Sabrás que la acrilamida se ha polimerizado cuando ya no puedas sacar la acrilamida de la pipeta).
6. Usando una pipeta de transferencia, agregue agua desionizada para que fluya suavemente a través de la superficie de la mezcla de poliacrilamida. La capa de agua asegura que el gel de poliacrilamida tendrá una superficie nivelada una vez que se polimerice.
7. Permita que el gel se polimerice, lo que toma ~15-20 minutos. Observará que la interfaz entre la poliacrilamida y la capa de agua desaparece temporalmente mientras que el polímero de gel- se va. Luego se forma una nueva interfaz nítida entre las dos capas, lo que indica que la polimerización está completa. (También puede verificar la poliacrilamida restante en la pipeta de transferencia para ver si se ha polimerizado).
8. Cuando se complete la polimerización, retire el agua de la parte superior del gel de resolución inclinando el gel hacia un lado y usando una toalla de papel o Kimwipe para mecha el agua.

Verter los geles apilables

NOTA DE SEGURIDAD: Asegúrese de usar gafas al verter los geles apilables.

1. Prepara los geles apilables. Mezclar la solución de acrilamida, tampón Tris pH 6.8 y agua, como se muestra en la tabla anterior.
2. Agregue 30 μL 10% APS y 7.5 μL TEMED a la mezcla de gel de acrilamida apilable. Mezcle el contenido invirtiendo suavemente el tubo dos veces.
3. Use una pipeta de transferencia para pipetear el gel apilable en la parte superior del gel de resolución entre las dos placas de vidrio. Agrega suficiente solución de apilamiento hasta que apenas llegue a la parte superior del plato pequeño.
4. Con cuidado, pero rápidamente, baje el peine a su posición, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. (El logo de Bio Rad en el peine debe estar frente a ti.) Agregar el peine obligará alguna solución a salir del gel, pero esto está bien. Si las burbujas de aire quedan atrapadas debajo del peine, retire el peine y vuelva a colocarlo.

Guarde los geles SDS-PAGE

1. Retire con cuidado los geles del soporte de fundición y luego de sus marcos verdes.

2. Manteniendo los peines en el gel, envuelva los geles en una toalla de papel húmeda. Luego envuelva los geles en una envoltura de plástico para ser utilizados en laboratorios posteriores. ¡Los geles se arruinarán si no se mantienen mojados y envueltos adecuadamente!