16.4: Micro-informe 3- Mapeo de restricción

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Figura: La figura en el corazón de este microreporte es un gel de agarosa que contiene las digestiones de restricción de los plásmidos de su equipo. Consulte las pautas del Micro-reporte 2 para ver cómo configurar figuras con geles de agarosa. El lector debe poder determinar a partir del gel y su leyenda qué plásmido se muestra en cada carril y qué endonucleasa de restricción (RE) se utilizó en cada digestión.

Materiales y Métodos: Para reproducir tus experimentos, un lector necesitará saber qué plásmidos y RE utilizó, cómo purificó los plásmidos y alguna información sobre los geles de agarosa utilizados para los mapas de restricción. Cuando sea posible, referirse a los procedimientos publicados, señalando cualquier modificación a un procedimiento publicado. Es posible que desee utilizar subtítulos para la sección de M&M.

Plásmidos: Los genes y los homólogas MET se han clonado en dos plásmidos de sobreexpresión de levaduras diferentes. Utilizar la nomenclatura correcta al hacer referencia a plásmidos de genotipos conocidos. Los nombres de los plásmidos comienzan con una “p” minúscula y están escritos en fuente normal. Para gran parte de este reporte, necesitarás referirte a los plásmidos solo por su número, ya que todavía estás tratando de identificarlos.

Purificación de plásmidos: Existen muchos métodos diferentes para aislar plásmidos, así que informe al lector que utilizó el kit ZyppyTM Plasmid Mimiprep (Zymo Research) con las modificaciones descritas en el manual de laboratorio. Incluya información sobre cómo estimó las concentraciones de ADN plasmídico, así como la concentración de ADN de cada plásmido purificado.

Digestos de restricción: Para reproducir tus experimentos, el lector querrá saber cuánto ADN plasmídico usaste en las digestiones y qué RE usaste. La relación de unidades RE a ADN es importante para los digestos exitosos. Su lector puede estar usando una fuente comercial diferente de RE, por lo que también proporcione el número de unidades enzimáticas (U) en la reacción. NO enumere los μL de cada componente utilizado en las reacciones. Asegúrese de incluir información sobre la temperatura y duración de la incubación.

Electroforesis en gel de agarosa: Consulte las pautas para el microreporte 2.

Resultados y Discusión: Trae al lector a través de la lógica para tu diseño experimental. ¿Por qué elegiste este RE en particular? Se refieren a las bandas en los geles como fragmentos de restricción. Los fragmentos de restricción son los productos de las digestiones RE.

El tamaño es muy importante en la interpretación de los resultados de un resumen de RE. Se debe incluir una única
tabla de datos resumida con los tamaños pronosticados y observados de los fragmentos de restricción. Estimar los tamaños de los fragmentos de restricción comparando su migración con los marcadores. Los tamaños previstos deben ser muy precisos, ya que se basan en las secuencias de ADN reales, las cuales tienen resolución de nucleótidos. Sus tamaños estimados son mucho menos precisos. Es posible que pueda determinar si un fragmento de restricción es más pequeño o más grande que otro, pero solo podrá colocar los fragmentos dentro de un cierto rango de tamaño. NOTA: los plásmidos circulares se ejecutan de forma anómala en geles de agarosa. Los plásmidos superenrollados migran más rápidamente en geles que una molécula de ADN lineal del mismo tamaño. Por el contrario, los plásmidos mellados (una sola hebra de la hélice se ha escindido, produciendo un círculo relajado) los plásmidos migran más lentamente que el ADN lineal del mismo tamaño. La digestión incompleta también puede complicar los resultados. ¡Ten en cuenta que el número de bandas en el gel no es tan importante como las diferencias en los patrones de bandas!

¿Tus resultados experimentales confirmaron tus predicciones? Si tus resultados no confirmaron tus predicciones, debes considerar si las predicciones fueron incorrectas O si las reacciones no funcionaron. El plásmido no digerido proporciona un control para interpretar este último problema.