9.14: E. coli como sistema modelo
- Page ID
- 53370
Cada superficie de tu cuerpo alberga un floreciente ecosistema microbiano. Esto es particularmente cierto en el sistema gastrointestinal, que va desde la boca y el esófago (con un desvío hacia la nariz), a través del estómago, hacia el intestino delgado y grueso y el colon 291. Cada uno de estos soportes de regiones es propia y única comunidad microbiana (conocida como microbioma). Estos ambientes difieren en términos de un número de propiedades, incluyendo diferencias en los niveles de pH y O 2. Cerca de la boca y esófago Los niveles de O 2 son altos y los microbios pueden utilizar la respiración aeróbica (dependiente de O 2) para extraer energía de los alimentos. Moviéndose por el sistema O 2 los niveles disminuyen hasta que son necesarios mecanismos anaeróbicos (sin O 2). En diferentes posiciones a lo largo de la vía gastrointestinal se encuentran microbios con diferentes preferencias ecológicas y adaptabilidades.
Un reto asociado con la caracterización de la complejidad exacta del microbioma presente en diversos lugares es que a menudo los organismos presentes dependen unos de otros para el crecimiento; cuando se aíslan entre sí no crecen. La forma estándar de contar las bacterias es cultivarlas en el laboratorio usando placas de medios de crecimiento. Las muestras se diluyen para que una sola bacteria aterrice (aisladamente una de otra) en la placa. Cuando crecen y se dividen, forman colonias macroscópicas y es posible contar el número de “unidades formadoras de colonias” (UFC) por volumen de muestra original. Esto proporciona una medida del número de bacterias individuales presentes. Si un organismo no puede formar una colonia bajo las condiciones de ensayo, parecerá estar ausente de la población. Pero como acabamos de mencionar algunas bacterias son totalmente dependientes de otras y por lo tanto no crecen aisladamente. Para evitar este problema, los métodos moleculares más nuevos utilizan análisis de secuencias de ADN para identificar qué organismos están presentes sin tener que cultivarlos 292. El resultado de este tipo de análisis revela la verdadera complejidad de los ecosistemas microbianos que viven en y dentro de nosotros 293.
Para nuestros propósitos, nos enfocaremos en un miembro bien conocido, pero relativamente menor de esta comunidad microbiana, Escherichia coli 294. E. coli es miembro de la familia de bacterias Enterobacteriaceae y se encuentra en el colon de aves y mamíferos 295. E. coli es lo que se conoce como aerobio facultativo, puede sobrevivir tanto en un ambiente anaeróbico como en un ambiente aeróbico. Esta flexibilidad, así como los requerimientos de nutrientes generalmente no fastidiosos de E. coli hacen que sea fácil de cultivar en el laboratorio. Además, la cepa de E. coli de laboratorio de uso común, conocida como K12, no causa enfermedad en humanos. Dicho esto, existen otras cepas de E. coli, como E. coli O157:H7 que es patógena (causante de enfermedad). E. coli O157:H7 contiene 1,387 genes que no se encuentran en la E. coli K12. Se estima que las dos cepas de E. coli divergieron de un ancestro común hace ~4 millones de años. Los detalles de lo que hace que E. coli O157:H7 sea patógena es un tema fascinante, pero más allá de nuestro alcance aquí 296.
Comportamiento adaptativo y redes génicas (la respuesta lac): La lactosa es un disacárido (un azúcar) compuesto por D-galactosa y D-glucosa. Es sintetizado, biológicamente, exclusivamente por mamíferos hembra. Los mamíferos utilizan la lactosa en la leche como fuente de calorías (energía) para los bebés. Una razón (se piensa) es que la lactosa no es fácilmente digerida por la mayoría de los microbios. El sistema de síntesis de lactosa se deriva de una modificación evolutiva de un gen ancestral que codifica la enzima lisozima. A través de la duplicación y mutación, se generó un gen que codifica la proteína α-lactoalbúmina. La α-lactoalbúmina se expresa únicamente en glándulas mamarias, donde forma un complejo con una proteína expresada ubicuamente, galactosiltransferasa, para formar la proteína lactosa sintasa 297.
E. coli es capaz de metabolizar la lactosa, pero sólo cuando no hay mejores azúcares (más fáciles) de comer. Si la glucosa u otros compuestos están presentes en el ambiente se desactivan los genes requeridos para metabolizar la lactosa. Se requieren dos genes para que E. coli metabolice la lactosa. El primero codifica lactosa permeasa. La lactosa, siendo grande y altamente hidrófila, no puede pasar a través de la membrana celular de E. coli. La lactosa permeasa es una proteína de membrana que permite que la lactosa ingrese a la célula, bajando su gradiente de concentración. El segundo gen involucrado en la utilización de lactosa codifica la enzima β-galactosidasa, que divide la lactosa en D-galactosa y D-glucosa, ambas de las cuales pueden ser metabolizadas por proteínas expresadas constitutivamente (es decir, todo el tiempo) dentro de la célula. Entonces, ¿cómo funciona exactamente este sistema? Cómo se apagan los genes de utilización de lactosa en ausencia de lactosa y cómo se encienden cuando la lactosa está presente y se necesita energía. Las respuestas ilustran principios generales de las redes de interacción que controlan la expresión génica.
En E. coli, como muchas bacterias, múltiples genes se organizan en lo que se conoce como operones. En un operón, una sola región reguladora controla la expresión de múltiples genes. También es común en bacterias que múltiples genes involucrados en una sola vía metabólica se localicen en el mismo operón (la misma región del ADN). Un enfoque poderoso para el estudio de los genes es buscar fenotipos mutantes relevantes. Como decíamos, la E. coli de tipo silvestre (es decir, normal) puede crecer sobre la lactosa como sus únicas fuentes de energía. Entonces, para entender la utilización de lactosa, podemos mirar E. coli mutante que no puede crecer sobre la lactosa 298. Para que la detección de tales mutaciones sea más relevante, primero verificamos para asegurarnos de que el mutante pueda crecer en glucosa. ¿Por qué? Porque no estamos realmente interesados (en este caso) en mutaciones en genes que interrumpen el metabolismo estándar, por ejemplo la capacidad de usar glucosa; buscamos comprender los genes involucrados en el proceso específico del metabolismo de la lactosa. Tal análisis reveló una serie de clases distintas de mutaciones:. algunas llevaron a una incapacidad para responder a la presencia de lactosa en el medio, otras llevaron a la desrepresión, es decir, la expresión constante de dos genes involucrados en la capacidad de metabolizar lactosa, lactosa permeasa y β-galactosidasa. En estas cepas mutantes ambos genes se expresaron donde estaba presente o no lactosa. Al mapear (usando el sistema Hfr, ver arriba) donde estas mutaciones están en el genoma de E. coli, y una serie de otros experimentos, se generó el siguiente modelo.
Los genes que codifican lactosa permeasa (LacY) y β-galactosidasa (lacZ) forman parte de un operón, conocido como operón lac. Este operón está regulado por dos factores distintos. El primero es el producto de un gen constitutivamente activo, lacI, que codifica un polipéptido que se ensambla en una proteína tetramérica que actúa como represor transcripcional. En una célula típica hay ~10 proteínas represoras lac presentes. La proteína represora lac se une a sitios en el promotor del operón lac. Cuando se une a estos sitios, la proteína represora bloquea la transcripción (expresión) del operón lac. Los sitios de unión del represor dentro del promotor del operón lac parecen ser sus únicos sitios de unión funcionalmente significativos en todo el genoma de E. coli. El segundo elemento regulador en el sistema se conoce como el sitio activador. Puede unirse a la proteína activadora del catabolito (o CAP), la cual es codificada por un gen ubicado fuera del operón lac. La actividad de unión al ADN de la CAP está regulada por la unión de un cofactor, el monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), el AMPc se acumula en la célula cuando los nutrientes, específicamente los nutrientes libres que entregan energía (como la glucosa) son bajos. Su presencia actúa como señal de que la célula necesita energía. En ausencia de AMPc, el CAP no se une ni activa la expresión del operón lac, sino que en su presencia (es decir, cuando se necesita energía), la proteína CAP-cAMP está activa, se une a un sitio en el promotor del operón lac, recluta y activa la ARN polimerasa, conduciendo a la síntesis de ARNs y proteínas de lactosa permeasa y β-galactosidasa. Sin embargo, incluso si los niveles de energía son bajos (y los niveles de AMPc son altos), el operón lac es inactivo en ausencia de lactosa debido a la unión de la proteína represora lac a sitios (marcados 0 1, 0 2 y 0 3) en lac la región reguladora de el operón.
Entonces, ¿qué sucede cuando la lactosa aparece en el ambiente de la célula? Bueno, obviamente nada, ya que las células están expresando el represor lac, por lo que no hay permeasa de lactosa presente, y la lactosa no puede entrar a la célula sin ella. Pero esa predicción supone que, a nivel molecular, el sistema funciona perfectamente y determinísticamente. Este no es el caso, sin embargo, el sistema es estocástico, que está sujeto a los efectos de procesos aleatorios, es ruidoso y probabilístico.Dado el pequeño número de moléculas represivas lac por célula (~10), existe una pequeña pero significativa posibilidad de que, al azar, el operón lac de una célula en particular esté libre de represor encuadernado. Si esto ocurre bajo condiciones en las que el CAP está activo entonces, si la lactosa está presente, vemos el efecto del bucle de retroalimentación positiva 299. Cuando se agrega lactosa, aquellas células que tienen, por casualidad, expresado tanto la permeasa de lactosa como de β-galactosidasa (un pequeño porcentaje de la población celular total) responderán: la lactosa ingresará a estas células (ya que la permeasa está presente) y, como la β-galactosidasa también está presente, se convertirá en alolactona (una reacción catalizada por β-galactosidasa. La alolactona se une e inhibe la actividad de la proteína represora lac. En presencia de alolactona el represor ya no inhibe la expresión del operón lac y hay un aumento adicional (~1000 veces) en la velocidad de expresión de la lactosa permeasa y β-galactosidasa. La β-galactosidasa también cataliza la hidrólisis de lactosa en D-galactosidasa y D-glucosa, que son luego se utiliza para impulsar el metabolismo celular. A través de este proceso, la célula pasa de esencialmente ninguna expresión del operón lac a la expresión completa, y con la expresión completa se vuelve capaz de metabolizar la lactosa. Al mismo tiempo, aquellas células que no expresaban (por casualidad) lactosa permeasa y β-galactosidasa no podrán metabolizar la lactosa en absoluto. Entonces, aunque todas las células de E. coli presentes en un cultivo pueden ser genéticamente idénticas, pueden expresar diferentes fenotipos debido a la naturaleza estocástica de la expresión génica. Un ejemplo de tal comportamiento se presenta en el applet 300 de conceptos básicos de expresión génica PhET. En el caso del sistema lac, con el tiempo la naturaleza ruidosa de la expresión génica lleva a que cada vez más células activen su copia del operón lac. Una vez “activado”, siempre y cuando la lactosa esté presente en el sistema, su entrada en la célula y su conversión en alolactona mantendrá la proteína represora lac en un estado inactivo y permitirá la expresión continua del operón lac.
¿Qué sucede si la lactosa desaparece del ambiente, qué determina cuánto tiempo tardan las células en regresar al estado en el que ya no expresan el operón lac? La respuesta está determinada por los efectos de la división celular y los procesos reguladores. En ausencia de lactosa la concentración de alolactona disminuye y la proteína represora lac vuelve a su estado activo e inhibe la expresión del operón lac. No se sintetizará ninguna nueva lactosa permeasa y β-galactosidasa y sus concentraciones disminuirán debido a la degradación. Al mismo tiempo, y nuevamente debido a que su síntesis se ha detenido, con cada división celular la concentración de la lactosa permeasa y β-galactosidasa disminuirá en ~ 50%. Con el tiempo las proteínas serán diluidas (y degradadas) y así las células regresarán al estado inicial, es decir, con el operón lac apagado y no hay copias de lactosa permeasa o β-galactosidasa presentes.