15.2: Hacer y cribar una biblioteca de ADNc
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El primer paso para hacer una biblioteca de ADNc es aislar ARNm celular. Este extracto de ARNm debe representar todos los transcritos en las células en el momento del aislamiento, o el transcriptoma de la célula. Este término es utilizado por analogía al genoma. Sin embargo, un genoma es toda la información genética de un organismo. En contraste, un transcriptoma (generalmente eucariota) refleja todos los genes expresados en un tipo de célula dado en un momento en el tiempo. Los ADNc transcritos revertidos de un extracto de ARNm también se denominan transcriptoma..., e igualmente, una biblioteca de ADNc. Una biblioteca de ADNc es un tubo lleno de células bacterianas que han captado (es decir, han sido transformadas con) plásmidos recombinados con ADNc. Las bibliotecas de ADNc hechas a partir de ARNm tomados de diferentes tipos de células o las mismas células cultivadas en diferentes condiciones están en efecto, diferentes transcriptomas. Cada uno refleja los ARNm transcritos en las células en el momento de su extracción. Cuando las células de una biblioteca de ADNc se extienden sobre una placa Petri de agar nutritivo, cada célula crece en una colonia de células; cada célula de la colonia es un clon de una célula de partida. Las bibliotecas de ADNc se pueden utilizar para aislar y secuenciar el ADN que codifica un polipéptido que estás estudiando.
Recordemos que el ARNm maduro en células eucariotas ha sido empalmado. Esto significa que los ADNc de células eucariotas no incluyen intrones. Los intrones, así como las secuencias de potenciadores y otros elementos reguladores dentro y alrededor de un gen deben ser estudiados en bibliotecas genómicas, para ser discutidos más adelante. Aquí nos fijamos en cómo hacer una biblioteca de cDNA.
A. Construcción de ADNc
El ARNm es solo un poco por ciento de una célula eucariota; la mayoría es ARNr. Pero esa pequeña cantidad de ARNm se puede separar de otros ARN celulares en virtud de sus colas poli (A) 3'. Simplemente pase un extracto de ARN total sobre una columna oligo-d (T) (ilustrada a continuación).
Las cadenas de timidina (T) pueden unirse H con las colas poli (A) de los ARNm, anclándolos a la columna. Todos los ARN sin una cola 3' poli (A) fluirán a través de la columna como desechos. Se pasa un segundo tampón sobre la columna para desestabilizar los enlaces H A-T para permitir la elución de una fracción de ARNm. Cuando se agrega oligo d (T) libre al ARNm eluido, forma enlaces H con las colas poli (A) de los ARNm, sirviendo como cebador para la síntesis de copias de ADNc de los ARNm poli (A) originalmente en las células. Finalmente, se agregan cuatro precursores de ADN desoxinucleotídico y transcriptasa inversa (originalmente aislados de células infectadas con retrovirus de pollo) para iniciar la transcripción inversa. A continuación se muestra la síntesis de una cadena de ADNc complementaria a un ARNm.
Después de calentar para separar los ADNc de los ARNm, el ADNc se replica para producir ADNc bicatenario o (ds), como se ilustra a continuación.
¡La síntesis de la segunda cadena de ADNc también es catalizada por la transcriptasa inversa! La enzima reconoce ADN así como moldes de ARN, y tiene la misma actividad de polimerización de ADN 5' a 3' que las ADN polimerasas. Después de la síntesis de la segunda cadena de ADNc, nucleasa S1 (¡una endonucleasa monocatenaria originalmente aislada de un hongo de Asia Oriental!) para abrir el bucle de la estructura del ADNc (ds) y recortar el resto del ADN monocatenario. Lo que queda es el (ds) cDNA.
B. Clonación de ADNc en vectores plasmídicos
Para entender la clonación de ADNc y otros aspectos de la fabricación de ADN recombinante, necesitamos hablar un poco más sobre el kit de herramientas de ADN recombinante. Además de la transcriptasa inversa y la nucleasa S1, otras enzimas necesarias en el 'kit' incluyen endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) y ADN ligasa. La función natural de las enzimas de restricción en bacterias es reconocer secuencias específicas de sitios de restricción en el ADN del fago (con mayor frecuencia secuencias de ADN palindrómico), hidrolizarlo y así evitar la infección.
Las enzimas de restricción que hacen que una tijera corte a través de las dos hebras de la doble hélice dejan extremos romos. Las enzimas de restricción que hacen un corte escalonado en cada hebra en su sitio de restricción dejan atrás extremos complementarios ('pegajosos') (abajo).
Si mezclas dos de los fragmentos de ADN bicatenario con los mismos extremos pegajosos de diferentes fuentes (por ejemplo, diferentes especies), formarán enlaces H en sus extremos complementarios, lo que facilita la recombinación de ADN plasmídico con (ds) ADNc, que tienen los mismos 'extremos pegajosos' complementarios. Usando el lenguaje de las tecnologías de ADN recombinante, veamos cómo se pueden hacer vectores plasmídicos y ADNc para recombinarse.
1. Preparación de vectores plásmidos recombinantes que contienen insertos de ADNc
Los vectores son ADN portadores diseñados para recombinarse con ADN foráneos de interés. Cuando un vector recombinante con su inserto de ADN extraño entra en una célula huésped, puede replicar muchas copias de sí mismo, lo suficiente de hecho para un fácil aislamiento y estudio. Los ADNc se insertan típicamente en vectores plasmídicos que generalmente se compran “listos para usar”. Se pueden cortar con una enzima de restricción en un lugar adecuado, dejando esos extremos pegajosos. Por otro lado, no serviría para digerir (ds) ADNc con endonucleasas de restricción ya que el objetivo no es clonar fragmentos de ADNc, sino moléculas de ADNc enteras. Por lo tanto, será necesario unir enlazadores a cualquiera de los extremos de los (ds) ADNc. Los ADN plasmídicos y las construcciones de enlazador de ADNc se pueden digerir con la misma enzima de restricción para producir “extremos pegajosos” compatibles. A continuación se muestran los pasos en la preparación del vector y (ds) ADNc para la recombinación.
Para prepararse para la recombinación, se digiere un vector plasmídico con una enzima de restricción para abrir el círculo de ADN. Para tener extremos pegajosos compatibles, los ADNc bicatenarios a insertar se mezclan con enlazadores y ADN ligasa para poner un ADN enlazador en ambos extremos del ADNc (ds). La ADN ligasa es otra herramienta en el kit de herramientas de ADN recombinante. Los enlazadores son oligómeros de ADN bicatenario sintéticos cortos que contienen sitios de restricción reconocidos y cortados por la misma enzima de restricción que el plásmido. Una vez que los enlazadores están unidos a los extremos de los ADN plasmídicos, se digieren con la enzima de restricción apropiada. Esto deja tanto los ADNc (ds) como los vectores plasmídicos con extremos pegajosos complementarios.
2. Recombinación de plásmidos e insertos de ADNc y transformación de células huésped
El siguiente paso es mezclar los plásmidos cortados con los enlazadores-ADNc digeridos en las proporciones adecuadas para que la mayor parte de los extremos del ADNc (enlazador) se hibriden (forman Hbonds) con la mayoría de los extremos plasmídicos pegajosos. La adición de ADN ligasa a la mezcla plásmido/enlazador-ADNc forma enlaces fosfodiéster entre el plásmido y el inserto de ADNc, completando el círculo recombinante de ADN, como se muestra a continuación.
En los primeros experimentos de clonación, una consideración importante fue generar plásmidos con una sola copia de un inserto de ADNc dado, en lugar de muchos plásmidos re-ligados sin insertos o muchos plásmidos con múltiples insertos. Mediante el uso de combinaciones de vectores y enlazadores mejordiseñados, este problema se volvió menos importante.
3. Transformación de células hospedadoras con plásmidos recombinantes
Las moléculas de ADN recombinante ya están listas para 'clonar'. Se agregan a E. coli (a veces otras células hospedadoras) hechas permeables para que puedan transformarse fácilmente. Recordemos que la transformación definida por Griffith es la captación bacteriana de ADN extraño que conduce a un cambio genético. ¡El principio transformante en la clonación es el plásmido recombinante! A continuación se muestra el paso de transformación.
El tubo lleno de células transformadas es la Biblioteca de ADNc.
262 Elaboración de la Biblioteca de ADNc.
Después de todos estos tratamientos, no todas las moléculas plasmídicas de la mezcla son recombinantes; algunas células de la mezcla ni siquiera han tomado un plásmido. Entonces, cuando las células recombinantes son sembradas en agar, ¿cómo se sabe cuál de las colonias que crecen provino de células que tomaron un plásmido recombinante? Tanto la cepa huésped de E. coli como los vectores plasmídicos utilizados en estos días se diseñaron adicionalmente para resolver este problema. Uno de estos vectores plasmídicos porta un gen de resistencia a antibióticos. En este caso, las células sensibles a ampicilina se transformarían con plásmidos recombinantes que contienen el gen de resistencia. Cuando estas células se colocan en placas sobre medios que contienen ampicilina (una forma de penicilina), crecen, como se ilustra a continuación.
Las células no transformadas (células que no lograron tomar un plásmido) carecen del gen de resistencia a ampicilina y, por lo tanto, no crecen en medio ampicilina. Pero, aún queda una pregunta. ¿Cómo se puede saber si las células que crecieron fueron transformadas por un plásmido recombinante que contenía un inserto de ADNc? ¡Es posible que algunos de los transformantes contengan solo plásmidos no recombinantes que aún tengan el gen de resistencia a ampicilina!
Para abordar esta pregunta, los plásmidos se diseñaron adicionalmente con un gen de resistencia a estreptomicina. Pero este gen de resistencia a antibióticos también fue diseñado para contener sitios de enzimas de restricción en el medio del gen. Así, insertar un ADNc en este plásmido alteraría e inactivaría el gen. Así es como este segundo bit de ingeniería genética permitió el crecimiento solo de células transformadas con un plásmido recombinante que contenía un inserto de ADNc. Podemos distinguir los transformantes que contienen plásmidos recombinantes aparte de los que contienen plásmidos no recombinantes mediante la técnica de réplica en placas que se muestra (ilustrada a continuación).
Después de que las colonias crezcan en la placa de agar ampicilina, coloque un filtro sobre la placa. El filtro recogerá algunas células de cada colonia, convirtiéndose en efecto una réplica (imagen especular) de las colonias en la placa. Colocar el filtro de réplica en una nueva placa de agar que contenga estreptomicina; las nuevas colonias que crezcan en el filtro deben ser resistentes a estreptomicina, conteniendo solamente plásmidos no recombinantes. Las colonias que contienen plásmidos recombinantes, las que no crecieron en estreptomicina se identifican fácilmente en la placa de agar ampicilina original. En la práctica, los procedimientos de recombinación y transformación altamente eficientes suelen revelar células muy resistentes a estreptomicina (es decir, colonias) después de la siembra en placas de réplica. En este caso, las células resistentes a ampicilina constituyen una buena biblioteca de ADNc, lista para el cribado.
4. Identificación de colonias que contienen plásmidos con insertos de interés
El siguiente paso es cribar las colonias de la biblioteca de ADNc en busca de aquellas que contienen el ADNc específico que buscas. Esto normalmente comienza a preparar múltiples filtros de réplica como el anterior. Recuerde, estos filtros son réplicas de células bacterianas que contienen plásmidos recombinantes que crecen sobre ampicilina pero no estreptomicina. El número de filtros de réplica que deben cribarse puede calcular a partir de suposiciones y fórmulas para estimar cuántas colonias deben cribarse para representar un transcriptoma completo (es decir, el número de ARNm diferentes en la fuente de ARNm celular original). Una vez realizado el número requerido de filtros de réplica, se someten a lisis in situ para romper las paredes celulares y las membranas. El resultado es que el contenido celular se libera y el ADN se desnaturaliza (es decir, se vuelve monocatenario). El ADN luego se adhiere al filtro en su lugar (in situ, donde estaban las colonias). El resultado de la lisis in situ es un filtro con tenues trazas de la colonia original (abajo).
A continuación, se utiliza una sonda molecular para identificar el ADN que contiene la secuencia de interés. La sonda es a menudo un oligonucleótido sintético cuya secuencia se infiere a partir de secuencias de aminoácidos conocidas. Estos oligonucleótidos se hacen radiactivos y se colocan en una bolsa con el (los) filtro (s). El ADN de células que contenían plásmidos recombinantes con un ADNc de interés se unirá a la sonda complementaria. A continuación se muestran los resultados de lisis in situ e hibridación de una sonda radiactiva a un filtro de réplica.
264 Sondeo de una réplica de filtro de placa
Los filtros se enjuagan para eliminar la sonda de oligómero radiactivo no unido y luego se colocan sobre una película de rayos X. Después de un periodo de exposición, se desarrolla la película. Se formarán manchas negras en la película a partir de la exposición radiactiva, creando una autorradiografía del filtro. Las manchas negras en la autoradiografía corresponden a colonias en un filtro que contienen un plásmido recombinante con su secuencia de ADNc diana (abajo).
Una vez que se identifica un clon positivo en la película, la colonia recombinante correspondiente se localiza en la placa original. Esta colonia se cultiva en un cultivo líquido y se aísla el ADN plasmídico. En ese punto, el ADN plasmídico clonado puede secuenciarse y la secuencia de aminoácidos codificada por su ADNc puede inferirse del diccionario de código genético para verificar que el inserto de ADNc de hecho codifica la proteína de interés. Una vez verificado como la secuencia de interés, un ADNc plasmídico clonado puede hacerse radiactivo o fluorescente, y usarse para
- sonda para los genes de los que se originaron.
- identificar y cuantificar el ARNm incluso localizar los transcritos en las células.
- medir cuantitativamente cantidades de ARNm específicos.
Los ADNc plasmídicos aislados pueden incluso expresarse en células adecuadas para producir la proteína codificada. En estos días, los diabéticos ya no reciben insulina porcina, sino que obtienen insulina humana sintética hecha de ADNc humanos expresados. Además, si bien la introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, ver más adelante) ha superado algunos usos de los ADNc, siguen desempeñando un papel en estudios a nivel de genoma y transcriptoma.