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15.5: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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    La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede amplificar una región de ADN de cualquier fuente, incluso a partir del valor de ADN de una sola célula o de fragmentos de ADN obtenidos de un fósil. Esta amplificación suele tardar apenas unas horas, generando millones de copias de la secuencia de ADN diana deseada. ¡El efecto es purificar el ADN de las secuencias circundantes en una sola reacción! Kary B. Mullis fue galardonado con el Premio Nobel en 1993 por su desarrollo de PCR, que ahora es la base de innumerables estudios de investigación de estructura, función y evolución de genes así como aplicaciones en forense criminal, diagnóstico médico y otros usos comerciales. La PCR se describe en detalle a continuación.

    A. PCR - el Proceso Básico

    La PCR típica se basa en conocer dos bits de secuencia de ADN que se utilizarán para diseñar y sintetizar secuencias cortas de oligonucleótidos (oligómeros) en el laboratorio. Los dos oligómeros se eligen para que sean complementarios a secuencias opuestas de cadenas de ADN bicatenario que contienen el gen a estudiar. Decimos que los dos oligómeros se enfrentan, o se oponen entre sí. Eso solo significa que el extremo 3' de un oligómero se enfrenta al extremo 3' del oligómero opuesto. De esta manera los dos oligómeros pueden servir como cebadores para la replicación de elongación de ambas cadenas de una secuencia de ADN diana bicatenaria. Consulte el siguiente enlace para obtener más explicaciones.

    272 PCR: Diseñar y sintetizar cebadores oligonucleotídicos opuestos

    El primer paso en la PCR es añadir cebadores oligoméricos al ADN diana a partir del cual se va a amplificar un gen (u otra secuencia genómica). Luego se calienta la mezcla para desnaturalizar el ADN diana. La mezcla se enfría para permitir que los cebadores se unan H a cadenas de ADN diana complementarias. A continuación, se añaden los cuatro desoxinucleótidos precursores del ADN (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) junto con una pequeña cantidad de una ADN polimerasa. Las nuevas cadenas de ADN ahora se alargarán a partir de los cebadores oligonucleotídicos en los ADN molde. Para hacer mucho el producto de PCR, este ciclo de reacción debe repetirse muchas veces. Por lo tanto, después de permitir la elongación, la mezcla se calienta para desnaturalizar (separar) todas las hebras de ADN. Cuando la mezcla se enfría de nuevo, los oligómeros vuelven a encontrar secuencias complementarias con las que se unen H. Las primeras versiones de PCR se basaron originalmente en una ADN polimerasa de E. coli, la cual se inactiva por calentamiento, por lo que tuvo que volver a agregarse a la mezcla de PCR para cada ciclo de elongación. Al igual que con la secuenciación del ADN, los investigadores cambiaron muy rápidamente a la polimerasa Taq termoestable, de Thermus aquaticus. Las enzimas de T. aquaticus permanecen activas a las temperaturas muy altas a las que viven estos organismos. Dado que el calentamiento no destruye la polimerasa Taq in vitro, la PCR, al igual que las reacciones de secuenciación de ADN, podrían automatizarse con termocicladores programables que elevaron y bajaron la temperatura requerida por las reacciones de PCR. Ya no hubo necesidad de reponer una ADN polimerasa una vez que se iniciaron los ciclos de reacción. El termociclado en una amplificación por PCR típica se ilustra a continuación para los dos primeros ciclos de PCR, el segundo de los cuales produce las primeras cadenas de ADN que realmente se amplificarán exponencialmente.

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    Se puede ver en la ilustración que el segundo ciclo de PCR ha generado las dos cadenas de ADN que serán moldes para duplicar y redoblar el producto deseado después de cada ciclo posterior. Una reacción PCR típica podría implicar 30 ciclos de PCR, dando como resultado una amplificación casi exponencial de la secuencia deseada.

    273 PCR: El proceso de amplificación

    Desafío:

    Comenzando con un par de moléculas de ADN diana complementarias (después del tercer ciclo de PCR), ¿cuántos productos de PCR bicatenarios debería tener teóricamente al final de los 30 ciclos de PCR?

    Los productos amplificados de los productos de amplificación por PCR están en tal abundancia que se pueden ver fácilmente bajo iluminación fluorescente en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio (abajo).

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    En este gel, el primer carril (a la izquierda) contiene una escalera de ADN, una mezcla de ADN de longitudes conocidas que se pueden utilizar para estimar el tamaño de los fragmentos de PCR en los carriles 3 o y 4 (el carril de gel al lado de la escalera está vacío). Las dos bandas brillantes en los carriles 3 y 4 son productos de PCR generados con dos pares de cebadores de oligómeros diferentes. Los ADN amplificados por PCR se pueden secuenciar y usar en muchos estudios posteriores.

    B. Los muchos usos de la PCR

    Los productos amplificados por PCR se pueden marcar con etiquetas radiactivas o fluorescentes para servir como sondas de hibridación para

    • cribado de bibliotecas de ADNc o genómicas y aislamiento de clones.
    • determinar la posición migratoria en una transferencia Southern.
    • determinar la posición de migración en una transferencia Northern (un nombre imaginario para los ARN que se separan por tamaño en geles y se borran al filtro).
    • ¡y más!

    1. PCR Cuantitativa

    Señalamos anteriormente que la PCR tiene amplias aplicaciones a la investigación, medicina y otras aplicaciones prácticas. Un avance importante fue la PCR cuantitativa, aplicada a estudios de expresión génica diferencial y regulación génica. En la PCR cuantitativa, los ADNc iniciales se amplifican para detectar no solo la presencia, sino también las cantidades relativas de transcritos específicos que se están realizando en las células.

    2. Forense

    Otra aplicación de la PCR es en la ciencia forense, para identificar a una persona u organismo comparando su ADN con algún ADN estándar, o control. A continuación se muestra un ejemplo de una de estas huellas de ADN de gel de acrilamida.

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    Con esta tecnología, ahora es posible detectar relaciones genéticas entre parientes cercanos y lejanos (así como excluir tales relaciones), determinar la paternidad, demostrar relaciones evolutivas entre organismos y, en muchas ocasiones, resolver crímenes recientes e incluso de 'casos fríos'. Haz clic en Sir Alec Jeffries para conocer los orígenes de las huellas de ADN en la vida real... ¡y en todos esos programas de CSI de TV! Consulte aquí para obtener una breve historia del nacimiento de las huellas de ADN, y para ver cómo el análisis de los cambios en la actividad génica que ocurren después de la muerte puede incluso ayudar a los delincuentes de identificación. Para ver un video sobre huellas de ADN, haga clic en Alu y huellas digitales de ADN. Alu es una secuencia de ADN altamente repetida de ~300 pb que se encuentra en todo el genoma humano. Las secuencias de Alu son elementos cortos intercalados, o SINES, un retrotransposón que vimos anteriormente. La toma de huellas de ADN es posible en parte porque cada uno de nosotros tiene un número y distribución únicos de los SINEs de Alu en nuestro genoma. Para leer más sobre Secuencias de Alu y diversidad humana, haga clic en Secuencias de Alu y Diversidad Humana.

    Ejemplos intrigantes del uso de la PCR para la identificación incluyen el establecimiento de las identidades de las momias egipcias, el zar ruso depuesto y asesinado durante la revolución rusa (junto con los miembros de su familia), y el recientemente desenterrado cuerpo del rey Ricardo 3 de Inglaterra. ¡Los protocolos y aplicaciones de PCR variantes son múltiples y a menudo bastante inventivos! Para obtener una lista, haga clic en Variaciones en PCR básica.

    274 El poder de la PCR: algunos ejemplos

    3. ¿Quiénes son tus Ancestros?

    El rastreo de su ascendencia étnica, racial y regional está relacionado con la toma de huellas de ADN, ya que se basa en la amplificación por PCR de genes y otras regiones de ADN y la comparación de estas sus secuencias para distinguir marcadores de ADN en bases de datos de secuencias grandes. El precio de estos servicios ha bajado, y como resultado, su popularidad ha subido en los últimos años. Por lo general, usted proporciona saliva o un hisopo salival (bucal) al servicio y ellos amplifican y secuencian el ADN en sus muestras. El análisis compara tus secuencias de ADN con secuencias de bases de datos que buscan patrones de marcadores étnicos y regionales que podrías compartir con las bases de datos. Con base en estas comparaciones, se le proporciona un mapa (más..., o menos) preciso de su ascendencia basada en ADN. Gente que está gastando alrededor de $100.00 (¡menos cuando está a la venta!) a menudo preguntan qué tan precisos son estos análisis y qué significan realmente. Por ejemplo, ¿qué significa si tu ADN dice que eres 5% nativo americano? De hecho, ¡diferentes servicios a veces pueden darte resultados diferentes! Puedes obtener algunas respuestas y explicaciones Pruebas de ascendencia de ADN.


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