3.5: Ejercicio 2 - observar cultivos de levaduras y bacterias

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Los estudiantes deben trabajar en grupos de tres. Cada estudiante debe preparar una de las tres diapositivas que se enumeran a continuación. Los estudiantes de un grupo deben compartir sus diapositivas. Cada grupo recibirá tres cultivos de S. cerevisiae (SC), S. pombe (SP) y E. coli (CE).

1. Etiquete las tres diapositivas. Cada portaobjetos contendrá dos muestras para su comparación. Los portaobjetos son lo suficientemente grandes como para acomodar dos muestras y dos cubreobjetos. Numere las diapositivas con un Sharpie (Use el área esmerilada, si la diapositiva tiene una.) Mientras trabaja, asegúrese de registrar cuál de las dos muestras está más cerca del extremo etiquetado de la diapositiva. Registre sus datos en los espacios que se proporcionan a continuación o en su libreta.

Diapositiva 1: comparar cultivos de S. pombe y S. cerevisiae.
Diapositiva 2: comparar cultivos de S. cerevisiae y E. coli.
Diapositiva 3: cultivos de S. pombe y E. coli con el objetivo 100X (1000X).

2. Preparar suspensiones concentradas de células cultivadas. Todos los cultivos celulares aparecen turbios, debido a que las densidades celulares son altas. Aun así, estarás observando unos microlitros de suspensión celular bajo el microscopio, y las células pueden ser pocas y distantes entre sí. Concentrar
los cultivos para asegurar que haya suficientes células en el campo de visión del microscopio para observaciones significativas.

Concentrar las células centrifugando los tubos de ensayo que contienen los cultivos para un recuento
de 10 en una microcentrífuga fijada a velocidad máxima. Mantenga pulsado el botón Quick en las microcentrífugas Labnet o el botón entre los dos diales de las microcentrífugas Eppendorf.
Retirar la mayor parte del medio de cultivo con una micropipeta P1000, hasta que el medio apenas cubra el sedimento celular.
Resuspender las celdas con el mezclador vorticial.

3. Transferir y teñir las muestras celulares.

• Transferir 2 μL de cada suspensión celular al portaobjetos, usando una micropipeta P20.
• Tinte las células añadiendo 6 μL de Yodo de Gram a cada suspensión celular con una micropipeta P20. Cubrir cada muestra con un cubreobjetos.

4. Observar muestras de las tres especies utilizando los objetivos 40X y 100X. Cada miembro de su grupo debe observar las dos especies en el portaobjetos que preparó. Trabajar con otro miembro del grupo para hacer observaciones de la tercera especie. Registre sus observaciones y responda las preguntas en los espacios siguientes.

Nota

La lente de inmersión en aceite es necesaria para el objetivo 100X, y este aceite puede dañar el objetivo 40X. Tenga cuidado de seguir exactamente las instrucciones a continuación.

¡Los pasos deben realizarse en el orden correcto para proteger las lentes!

Enfocar el microsopo en un cultivo de s. cerevisiae o s. pombe. Enfoca primero con el objetivo 10X, luego pasa al objetivo 40X y vuelve a enfocar con el control de enfoque fino. Registre sus observaciones.
¡Ya está listo para pasar al objetivo de inmersión en aceite 100X! Gire la pieza de nariz a mitad de camino entre los objetivos 40X y 100X. SIN mover el escenario, aplica una gota de aceite de inmersión en la parte superior de tu cubreobjetos donde la luz brilla a través del tobogán. Gire lentamente el objetivo 100X en su lugar, sumergiéndolo en la gota de aceite. Usa la perilla de enfoque FINE para enfocar la levadura. Registre sus observaciones.
Vuelva a girar la pieza nasal a mitad de camino entre los objetivos 40X y 100X. No intente mover la etapa con el objetivo 100X en su lugar.
Usa los controles XY para mover el escenario a la segunda muestra en el portaobjetos SIN cambiar el enfoque.
Gire la lente 40X a su posición. Ajusta el enfoque y registra tus observaciones.
Repita el paso 2 anterior y registre sus observaciones a 100X.
Gire el objetivo 100X fuera de posición. Retire el portaobjetos y deséchelo en los desechos de vidrio. Limpie la lente 100X con papel para lentes. Verifique que no haya aceite presente en ninguna de las otras lentes.

Observaciones de S. cerevisiae
Esboza las celdas que ves con las dos lentes diferentes en los recuadros de abajo.

¿Qué fracción de las células muestran cogollos?
¿Se puede detectar alguna estructura subcelular con un aumento de 1000X?

Observaciones de S. pombe
Esboza las celdas que ves con las dos lentes diferentes en los recuadros de abajo.

¿Qué fracción de las células muestran septos?
¿Se puede detectar alguna estructura subcelular con un aumento de 1000X?

Observaciones de E. coli
Esboce las células que ve con las dos lentes diferentes en los recuadros de abajo.

¿Qué fracción de las células son móviles?
¿Cómo describirías la estructura de una E. coli?