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# 4.5: Ejercicio 2 - Placas puntuales

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Los científicos utilizan placas puntuales tanto para calcular el número de células en cultivos como para obtener información sobre las propiedades de crecimiento de cepas en diferentes medios. La siguiente figura
muestra un ejemplo de una placa puntual típica. Cada fila representa una serie de dilución de un cultivo de levadura diferente. Se utiliza el mismo volumen de cultivo diluido para cada mancha. La serie de dilución se planifica de manera que las manchas más diluidas contengan un pequeño número de colonias individuales que puedan distinguirse entre sí, típicamente menos de diez.

Placa puntual.

Cada fila en la placa representa una serie de diluciones 1:10 de un cultivo líquido de S. cerevisiae. Cinco μL de cada dilución fueron manchados en la placa. La placa se incubó durante dos días a 30° C. Las colonias individuales son evidentes a la dilución más alta de cada extracto.

Más comúnmente, los investigadores hacen una serie de diluciones 1:10 en agua estéril y luego detectan algunos microlitros de cada dilución en una fila. En este experimento, se mancharon alícuotas de 5 μL a partir de las diluciones seriadas. Tenga en cuenta que es posible contar colonias individuales en las muestras más diluidas. Esto a su vez le permite calcular el número de células viables en el cultivo original. En la fila superior, se pueden distinguir 4 colonias en la muestra que se ha diluido 100.000 veces. El cultivo original habría contenido 400,000 células en 5 μL, lo que corresponde a 80 millones de células por mL (8 x 107 células/mL).

En este experimento, utilizará placas puntuales para estimar las densidades celulares de cultivos en fase logarítmica y en fase estacionaria de S. cerevisiae y S. pombe. Cada grupo recibirá cuatro culturas:

S. cerevisiae cultivo en fase logarítmica
PL - S. pombe cultivo en fase logarítmica
CS - S. cerevisiae cultivo en fase estacionaria PS - S. pombe cultivo en fase estacionaria

Coloque las series de dilución de cada cultivo en una fila separada de la placa. ¡Asegúrate de ETIQUEAR las filas!

Preparación de la placa puntual

1. ¡Las rejillas de alineación son útiles para preparar placas puntuales de buen aspecto! Obtener una cuadrícula de alineación (derecha) y marcar las posiciones objetivo para diluciones de cultivo. Coloque una marca de orientación en un punto a lo largo de la circunferencia.

2. Etiquete el plato con sus iniciales y feche con letras minúsculas alrededor del borde INFERIOR del plato. Poner una marca hash en el borde del plato para que sirva como marcador de alineación.

3. Preparar una serie de cinco diluciones 1:10 de cada cultivo usando agua estéril. (Los diagramas en su cuaderno de laboratorio suelen ser útiles para diseñar series de dilución). Para preparar una dilución en serie, primero pipetee 90 μL de agua estéril en cinco tubos de microcentrífuga. A continuación, use un P20 para transferir 10 μL del cultivo original al primer tubo. Expulse la punta en el contenedor de residuos apropiado.

4. Vórtice el cultivo recién diluido para asegurar que las células estén distribuidas uniformemente. Con una punta de micropipeta fresca, transfiera 10 μL de este tubo al segundo tubo de la serie. Repita este paso para los tubos 3-5.

1. Prepare la placa de manchas. Comenzando con la última dilución de la serie, se localizan manchas de 5 μL seguidas. Vórtice cada dilución antes de mancharla, porque las células pueden haberse asentado. Podrás utilizar una sola punta de pipeta para cada serie de diluciones, ya que empezaste con la suspensión celular más diluida.
2. Repita el paso 3 para cada cultura que esté analizando. ¡Tenga cuidado de anotar en su cuaderno de laboratorio qué cultivo se ha visto en cada fila del plato!
3. Dejar el plato con el lado derecho hacia arriba durante ~30 minutos, para dejar tiempo para que la levadura se asiente y se adhiera al medio.

8. Cuando las células se hayan asentado, invierta las placas e incubarlas a 30°C, las placas se invirtieron para evitar que las gotas de agua que se forman en la superficie interna del párpado caigan sobre las colonias. Las placas también se pueden mantener a temperatura ambiente, pero las células crecerán más lentamente.

9. Cuando las colonias sean lo suficientemente grandes para contar, las placas serán retiradas de la incubadora por el personal y colocadas en el refrigerador o cámara fría para su análisis posterior.

10. En la siguiente clase: Registre sus datos con el escáner. Para ello, retire la parte superior de cada plato e invierta tanto la placa como su tapa. Coloca la mitad inferior del plato en el escáner y deja la tapa invertida en el banco. (El párpado se invierte para evitar la contaminación por esporas y microorganismos que puedan estar presentes en el aire). Coloque un trozo de cartón negro o una carpeta sobre las placas antes de bajar la tapa del escáner.

11. Use manchas donde pueda contar colonias individuales para calcular la densidad de células en el cultivo celular original, corrigiendo para las diluciones y el volumen de la mancha (ver arriba).

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