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11.3: Ejercicio 1 - Planear el compendio de restricción

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Asigne a cada persona de su grupo un plásmido diferente para analizar.

Primero necesitará ensamblar las secuencias completas de sus plásmidos de sobreexpresión combinando el plásmido y las secuencias del gen MET. Recordemos que los genes de S. cerevisiae han sido clonados en el vector pBG1805 y que los genes de S. pombe y lacZ han sido clonados en el vector pYES2.1. Luego generará un mapa de restricción que se puede usar para predecir fragmentos de restricción generados en una digestión RE. Para generar el mapa, utilizaremos una de varias herramientas en línea que están disponibles en la página web de New England Biolabs, un proveedor comercial de RE.

Usa la tabla a continuación para calcular la longitud de tu plásmido a medida que completes los primeros pasos de este ejercicio.

1. Localice la secuencia codificante de su gen.

• Abra el registro de su gen MET o su homólogo en SGD o Pombase, respectivamente.
• Encuentra el número de aminoácidos en tu proteína. Multiplique este número por 3 para encontrar el número de nucleótidos en el CDS. Agrega este número a la tabla anterior.
• Encuentra la secuencia CDS para tu gen. Pegar esta secuencia hasta el final de la secuencia plasmídica en el paso 2.
• La secuencia pYES2.1- LacZ está publicada en Canvas, por lo que los pasos 1 y 2 ya están hechos para este plásmido. Nótese que el gen del plásmido lacZ se ha modificado a partir de genes lacZ naturales.

2. Ensamble la secuencia completa de nucleótidos de su plásmido.

• Abra el documento de Word que contiene la secuencia vectorial pYES2.1 publicada en Canvas. Las secuencias plasmídicas se numeran de manera que el promotor GAL1 esté en el extremo 3' de la secuencia de ADN.
• Copia el CDS de SGD o Pombase y pegarlo al final de la secuencia plasmídica.
• Eliminar los últimos tres nucleótidos del CDS, que comprenden el codón de terminación del gen. Los plásmidos de sobreexpresión están diseñados para codificar proteínas de fusión con exten- siones C-terminales. (Nota: el codón de terminación en la secuencia lacZ ha sido eliminado por el fabricante.)

3. Preparar un mapa de restricción de la secuencia plasmídica completa.

• Pegue la secuencia del paso 2 en el cuadro de búsqueda en la herramienta NebCutter: nc2.neb.com/nebcutter2/
• Marque la casilla para indicar que el plásmido es CIRCULAR, en lugar de lineal.
• También podrías querer darle un nombre a tu plásmido. El sitio NEB almacenará sus consultas durante 24 horas, lo que puede ser muy conveniente. Haga clic en enviar.
• La herramienta de búsqueda devolverá resultados para un número desconcertante de RE. La gran mayoría de los sitios RE no son útiles, porque los fragmentos son demasiado grandes o demasiado pequeños, la enzima no está disponible en el laboratorio, o la endonucleasa es sensible a la metilación del ADN (que puede ser impredecible).

4. Realiza digestiones personalizados con enzimas que parecen prometedoras.

• Haga clic en el enlace de resumen personalizado. Esto muestra un gráfico de RE que cortan el plásmido, sus sitios de reconocimiento, el número de sitios de reconocimiento y la cantidad de actividad enzimática en

cada uno de cuatro búferes.

• Analice los fragmentos que producirían los cuatro RE siguientes marcando la casilla y haciendo clic en el botón verde Enviar.
AcCi HinciI ScaI XbaI

(Nota: Puede haber algunos cambios en esta lista de RE disponibles antes del laboratorio.)

5. Prepare una tabla que resuma los mapas de restricción para sus tres plásmidos.

• Complete la siguiente tabla, indicando los tamaños de los fragmentos de restricción generados con cada RE.
• Incluir la longitud total del plásmido en la tabla. La suma de las longitudes de los fragmentos de restricción debe sumar hasta este número.

6. Elija un RE que distinga sus tres plásmidos.
El equipo debe utilizar la tabla de datos anterior para seleccionar el RE que mejor le permita distinguir los tres plásmidos. Estaremos analizando los fragmentos de restricción en geles de agarosa al 1%, los cuales hacen un buen trabajo al resolver fragmentos que varían en tamaño de ~500 pb a ~5000bp. Consulte la figura del Capítulo 8, que muestra la distribución de marcadores de tamaño molecular en geles de agarosa al 1%. Elija un RE que produzca digestiones de restricción con una buena variedad de tamaños de fragmentos.

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