15.3: Las proteínas codificadas por plásmidos tienen etiquetas C-terminales

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En este laboratorio, utilizaremos anticuerpos para detectar proteínas de fusión Met y LacZ expresadas en S. cerevisiae transformadas. Estas proteínas de fusión han sido diseñadas para agregar varios elementos funcionales a los terminales C de las proteínas Met y LacZ. En consecuencia, las proteínas de fusión expresadas a partir del pBG1805 (Gelperin et al. , 2005) y los plásmidos pYES2.1 tienen etiquetas C-terminales que

puede interactuar con una variedad de reactivos. Cada uno de los plásmidos codifica etiqueta (s) epitopo (s) que pueden detectarse con anticuerpos en Western blots. Estos epítopos corresponden a secuencias de aminoácidos altamente inmunogénicas en las superficies de virus que han demostrado ser potentes inductores de la producción de anticuerpos. La secuencia pBG1805 codifica una secuencia de 9 aminoácidos de la proteína hemaglutinina (HA) del virus de la influenza humana (Sleigh et al. , 1981), mientras que el plásmido pYES2.1 codifica una secuencia de 15 aminoácidos de la proteína P del virus de simios V5 (Southern et al. , 1991). En nuestras inmunotransferencia, utilizaremos un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína V5, en lo sucesivo denominado anti-V5, para detectar proteínas expresadas a partir de plásmidos basados en pYES2.1.

El plásmido pYES2.1 también codifica una etiqueta que consiste en 6 histidinas. Esta etiqueta His ₆ se une fuertemente a los iones metálicos, por lo que se usa comúnmente para purificar proteínas sobreexpresadas haciéndolas pasar a través de una resina con iones de zinc o cobalto inmovilizados. Desafortunadamente, la etiqueta _{His 6} no es muy inmunogénica, por lo que rara vez se usa en las Western Blots. En conjunto, las etiquetas V5 y His ₆ agregan ~5 kDa al peso molecular de la proteína expresada.