19.3: Ensayos Epigenómicos

ChIP: un método para determinar dónde se unen las proteínas al ADN o dónde se modifican las histonas

Dada la importancia de la información epigenómica en biología, se han realizado grandes esfuerzos para estudiar señales que cuantifiquen esta información. Un método común para la medición de marcas epigenómicas se llama inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). La tecnología ChIP produce fragmentos de ADN cuya ubicación en el genoma denota las posiciones de una modificación histona particular o factor de transcripción. Los procedimientos de ChIP se describen como sigue y se representan en la Figura 19.2:

1. Las células se exponen a un agente reticulante como el formaldehído, lo que hace que se formen enlaces covalentes entre el ADN y sus proteínas unidas (por ejemplo, histonas con modificaciones específicas).
2. El ADN genómico se aísla del núcleo celular.
3. El ADN aislado es cizallado por sonicación o enzimas.
4. Los anticuerpos se cultivan para reconocer una proteína específica, como las involucradas en la modificación de histonas. Los anticuerpos se cultivan exponiendo las proteínas de interés a mamíferos, como cabras o ratas, cuya respuesta inmune provoca entonces la producción de los anticuerpos deseados.
5. Se añaden anticuerpos a la solución para inmunoprecipitar y purificar los complejos.
6. Se invierte la reticulación entre la proteína y el ADN y se purifican los fragmentos de ADN específicos de las marcas epigenéticas.

Después de un experimento ChIP, tenemos secuencias cortas de ADN que corresponden a lugares donde las histonas estaban unidas al ADN. Para identificar la ubicación de estos fragmentos de ADN en el genoma, se pueden hibridarlos con segmentos de ADN conocidos en una matriz o chip génico y visualizarlos con marcas fluorescentes; este método se conoce como Chip-chip. Alternativamente, se puede hacer una secuenciación masiva paralela de próxima generación de estos fragmentos; esto se conoce como CHIP-seq. Este último enfoque, Chip-seq, es un enfoque más nuevo que se usa con mucha más frecuencia. Se prefiere porque tiene un rango dinámico de detección más amplio y evita problemas como la hibridación cruzada en Chip-chip.

Cada etiqueta de secuencia tiene 30 pares de bases de largo. Estas etiquetas se mapean a posiciones únicas en el genoma de referencia de 3 mil millones de bases. El número de lecturas depende de la profundidad de secuenciación, pero normalmente hay del orden de 10 millones de lecturas mapeadas para cada experimento de Chip-seq.

Existe una tubería bastante estándar utilizada para inferir el enriquecimiento de la proteína de interés en cada sitio del genoma dado un conjunto de lecturas de secuenciación cortas de un experimento de ChIP-seq. Primero, los fragmentos de ADN deben mapearse al ADN (llamado mapeo de lectura). A continuación, debemos determinar qué regiones del genoma tienen un enriquecimiento estadísticamente significativo de la proteína de interés (llamada llamada pico). Después de estos pasos de preprocesamiento, podemos construir diferentes modelos supervisados y no supervisados para estudiar los estados de la cromatina y su relación con la función biológica. Nos fijamos en cada uno de estos pasos a su vez.

Secuenciación de bisulfito: un método para determinar dónde está metilado el ADN

La metilación del ADN fue la primera modificación epigenómica que se descubrió y es un importante regulador transcripcional, ya que la metilación de residuos de citosina en dinucleótidos CpG da como resultado “silenciamiento” o represión de la transcripción. La secuenciación de bisulfito es un método mediante el cual el ADN se trata con bisulfito antes de la secuenciación, permitiendo la determinación precisa de los nucleótidos en los que el ADN había sido metilado. El tratamiento con bisulfito convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo, pero no afecta a las cytosinas metiladas. Así, el ADN genómico puede secuenciarse con o sin tratamiento con bisulfito, y las secuencias pueden compararse, y los sitios en los que la citosina no se ha convertido en uracilo en el ADN tratado (o, equiv- almente, sitios en los que hay diferencia generada por bisulfito entre las secuencias tratadas y no tratadas) son sitios en los que la citosina fue metilada. Este análisis supone la conversión completa de residuos de citosina no metilados a uracilo, por lo que la conversión incompleta puede dar como resultado falsos positivos (es decir, nucleótidos identificados como metilados pero que de hecho no estaban metilados) [11].