9.1: Regulación de la Expresión Génica en Bacterias

El Operón

Dentro de su minúscula célula, la bacteria E. coli contiene toda la información genética que necesita para metabolizarse, crecer y reproducirse. Puede sintetizar cada molécula orgánica que necesita a partir de la glucosa y una serie de iones inorgánicos. Muchos de los genes en E. coli se expresan constitutivamente; es decir, siempre están “activados”. Otros, sin embargo, están activos sólo cuando sus productos son necesarios por la célula, por lo que su expresión debe ser regulada.

Dos ejemplos:

• Si se agrega el aminoácido triptófano (Trp) al cultivo, las bacterias pronto dejan de producir las cinco enzimas previamente necesarias para sintetizar Trp a partir de intermedios producidos durante la respiración de la glucosa. En este caso, la presencia de los productos de acción enzimática reprime la síntesis enzimática.
• Por el contrario, agregar un nuevo sustrato al medio de cultivo puede inducir la formación de nuevas enzimas capaces de metabolizar ese sustrato. Si tomamos un cultivo de E. coli que se alimenta de glucosa y transferimos algunas de las células a un medio que contiene lactosa en su lugar, se produce una secuencia reveladora de eventos.
  • Al principio las células están quiescentes: no metabolizan la lactosa, sus otras actividades metabólicas disminuyen y cesa la división celular.
  • Pronto, sin embargo, el cultivo comienza a crecer rápidamente nuevamente con la lactosa consumiéndose rápidamente. ¿Qué ha pasado? Durante el intervalo de reposo, las células comenzaron a producir tres enzimas.

Las tres enzimas son

• una permeasa que transporta lactosa a través de la membrana plasmática desde el medio de cultivo hacia el interior de la célula
• beta-galactosidasa que convierte la lactosa en la alolactosa intermedia y luego la hidroliza en glucosa y galactosa. Una vez en presencia de lactosa, la cantidad de beta-galactosidasa en las células aumenta de una pequeña cantidad a casi 2% del peso de la célula.
• una transacetilasa cuya función aún es incierta.

El operón lac

La capacidad de responder a la presencia de lactosa siempre estuvo ahí. Los genes para las tres enzimas inducidas son parte del genoma de la célula. Pero hasta que se añadió lactosa al medio de cultivo, estos genes no se expresaron (la β-galactosidasa se expresó débilmente —lo suficiente para convertir la lactosa en alolactosa). La forma más directa de controlar la expresión de un gen es regular su velocidad de transcripción; es decir, la velocidad a la que la ARN polimerasa transcribe el gen en moléculas de ARN mensajero (ARNm).

Figura 9.1.1 La transciprción de ADN lac

La transcripción génica comienza en un nucleótido particular que se muestra en la figura como "+1”. La ARN polimerasa realmente se une a un sitio “aguas arriba” (es decir, en el lado 5') de este sitio y abre la doble hélice para que pueda comenzar la transcripción de una cadena. El sitio de unión para la ARN polimerasa se llama promotor. En las bacterias, dos características del promotor parecen ser importantes:

• una secuencia de TATAAT (o algo similar) centrada 10 nucleótidos cadena arriba del sitio +1 y
• otra secuencia (TTGACA o algo bastante cercano a ella) centrada 35 nucleótidos cadena arriba.

La secuencia exacta de ADN entre las dos regiones no parece ser importante. Cada una de las tres enzimas sintetizadas en respuesta a la lactosa está codificada por un gen separado. Los tres genes están dispuestos en tándem en el cromosoma bacteriano.

Figura 9.1.2 El Operón lac

En ausencia de lactosa, la proteína represora codificada por el gen I se une al operador lac e impide la transcripción. La unión de la alolactosa al represor hace que salga del operador. Esto permite que la ARN polimerasa transcriba los tres genes del operón. La única molécula de ARNm que resulta se traduce luego en las tres proteínas.

El represor lac se une a una secuencia específica de dos docenas de nucleótidos llamada operador. La mayor parte del operador está aguas abajo del promotor. Cuando el represor se une al operador, la ARN polimerasa es incapaz de proceder aguas abajo con su tarea de transcripción génica. El represor lac representa solo una pequeña fracción de las proteínas en la célula de E. coli.

El operón es la combinación del operador y los tres genes que codifican proteínas asociados con él.

El gen que codifica el represor lac se denomina gen I. Sucede que se localiza justo aguas arriba del promotor lac. Sin embargo, su ubicación precisa probablemente no sea importante porque logra su efecto por medio de su producto proteico, el cual es libre de difundirse por toda la célula. Y, de hecho, los genes para algunos represores no se encuentran cerca de los operadores que controlan.

Si bien los represores son libres de difundirse a través de la célula, ¿cómo —por ejemplo— el represor lac encuentra el tramo único de 24 pares de bases del operador de los 4.6 millones de pares de bases de ADN en el genoma de E. coli? Resulta que el represor es libre de unirse a cualquier parte del ADN usando ambos

• enlaces de hidrógeno y
• interacciones iónicas (electrostáticas) entre sus aminoácidos cargados positivamente (Lys, Arg) y las cargas negativas en la cadena principal de desoxirribosa-fosfato del ADN.

Una vez a horca del ADN, el represor puede moverse a lo largo de él hasta encontrar la secuencia operadora. Ahora un cambio alostérico en la estructura terciaria de la proteína permite que los mismos aminoácidos establezcan enlaces —principalmente enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas— con bases particulares en la secuencia operadora.

El represor lac está formado por cuatro polipéptidos idénticos (por lo tanto, un “homotetrámero”). Parte de la molécula tiene un sitio (o sitios) que le permiten reconocer y unirse a los 24 pares de bases del operador lac. Otra parte del represor contiene sitios que se unen a la alolactosa. Cuando la alolactosa se une con el represor, provoca un cambio en la forma de la molécula, de manera que ya no puede permanecer unida a la secuencia de ADN del operador. Así, cuando se agrega lactosa al medio de cultivo, provoca que el represor se libere del operador y la ARN polimerasa ahora puede comenzar a transcribir los 3 genes del operón en una sola molécula de ARN mensajero.

Apenas comienza la transcripción, antes de que los ribosomas se adhieran a la molécula de ARNm en crecimiento y la bajen para traducir el mensaje en las tres proteínas. Se puede ver por qué los codones de puntuación —UAA, UAG o UGA— son necesarios para terminar la traducción entre las porciones del ARNm que codifica para cada una de las tres enzimas. Este mecanismo es característico de las bacterias, pero difiere en varios aspectos del que se encuentra en los eucariotas:

• Los genes en eucariotas no están ligados en operones (excepto nematodos como C. elegans y tunicados como Ciona intestinalis).
• Las transcripciones primarias en eucariotas contienen la transcripción de un solo gen (con las excepciones anteriores).
• La transcripción y la traducción no están físicamente ligadas en eucariotas como lo están en las bacterias; la transcripción ocurre en el núcleo mientras que la traducción ocurre en el citosol (con algunas excepciones).

C. elegans

C. elegans difiere de la mayoría de los eucariotas en tener una fracción sustancial (15-20%) de sus genes agrupados en operones que contienen de 2 a 8 genes cada uno. Al igual que las bacterias, todos los genes en un operón se transcriben a partir de un solo promotor produciendo un único transcrito primario (pre-ARNm). Algunos de los genes en estos operones parecen —como en las bacterias— estar involucrados en la misma función bioquímica, pero tal vez este no sea el caso para la mayoría. Los operones de C. elegans también difieren de los de las bacterias en que cada pre-ARNm se procesa en un ARNm separado para cada gen en lugar de traducirse como una unidad.

Corepressors

Como se mencionó anteriormente, la síntesis de triptófano a partir de precursores disponibles en la célula requiere 5 enzimas. Los genes que codifican estos se agrupan en un solo operón con su propio promotor y operador. En este caso, sin embargo, la presencia de triptófano en la célula apaga el operón. Cuando Trp está presente, se une a un sitio en el represor Trp y permite que el represor Trp se una al operador. Cuando Trp no está presente, el represor deja su operador y comienza la transcripción de los 5 genes que codifican enzimas.

Figura 9.1.3: Represor de triptófano cortesía de P. B. Sigler

La imagen anterior muestra una vista estéreo del represor triptófano (lado derecho de cada panel) unido a su ADN operador (lado izquierdo). El represor es un homodímero de dos polipéptidos idénticos (a cada lado de la línea roja horizontal). La unión al ADN ocurre solo cuando una molécula de triptófano (anillos rojos) se une a cada monómero del represor. La utilidad para la célula de este mecanismo de control es clara. La presencia en la célula de un metabolito esencial, en este caso triptófano, desactiva su propia fabricación y así detiene la síntesis de proteínas innecesarias. Como su nombre indica, los represores son mecanismos de control negativo, apagando operones

• en ausencia de un sustrato (lactosa en nuestro ejemplo) o
• la presencia de un metabolito esencial (el triptófano es nuestro ejemplo).

Sin embargo, algunas transcripciones de genes en E. coli están bajo control positivo.

Control Positivo de Transcripción: CAP

La ausencia del represor lac es esencial pero no suficiente para la transcripción efectiva del operón lac. La actividad de la ARN polimerasa también depende de la presencia de otra proteína de unión al ADN llamada proteína activadora de catabolitos (CAP). Al igual que el represor lac, CAP tiene dos tipos de sitios de unión: Uno se une al nucleótido AMP cíclico y el otro se une a una secuencia de 16 pares de bases aguas arriba del promotor

Sin embargo, la CAP puede unirse al ADN solo cuando el AMPc se une a CAP.así que cuando los niveles de AMPc en la célula son bajos, la CAP no logra unirse al ADN y por lo tanto la ARN polimerasa no puede comenzar su trabajo, incluso en ausencia del represor. Entonces el operón lac está bajo control tanto negativo (represor) como positivo (CAP). ¿Por qué?

Resulta que no se trata simplemente de cinturón y tirantes. Este sistema dual permite a la célula tomar decisiones. ¿Qué debe hacer, por ejemplo, la célula cuando se alimenta tanto con glucosa como con lactosa? Presentada con tal elección, E. coli (por razones sobre las cuales solo podemos especular) elige la glucosa. Hace su elección mediante el uso de la interacción entre estos dos dispositivos de control.

Figura 9.1.4 Control de la CAP de Transciprción

Aunque la presencia de lactosa elimina el represor, la presencia de glucosa disminuye el nivel de AMPc en la célula y así elimina la capo.Sin CAP, la unión de la ARN polimerasa se inhibe aunque no haya represor que interfiera con ella si pudiera unirse. La base molecular para sus elecciones se muestra en la figura anterior.

La CAP consiste en dos polipéptidos idénticos (de ahí que sea un homodímero). Hacia el C-terminal, cada una tiene dos regiones de hélice alfa con una curva pronunciada entre ellas. El más largo de estos se llama la hélice de reconocimiento porque es responsable de reconocer y unirse a una secuencia particular de bases en el ADN.

Figura 9.1.5 Modelo de CAP

La figura anterior muestra un modelo de CAP. Los dos monómeros son idénticos. Cada monómero reconoce una secuencia de nucleótidos en el ADN por medio de la región de hélice alfa marcada con F. Obsérvese que las dos hélices de reconocimiento están espaciadas 34Å, que es la distancia que toma la molécula de ADN (a la izquierda) para hacer precisamente un giro completo.

Figura 9.1.6 Hélice de reconocimiento

Las hélices de reconocimiento de cada polipéptido de CAP son, por supuesto, idénticas. Pero su orientación en el dímero es tal que la secuencia de bases que reconocen debe correr en la dirección opuesta para que cada hélice de reconocimiento se una correctamente. Esta disposición de dos secuencias idénticas de pares de bases que se ejecutan en direcciones opuestas se denomina repetición invertida.
La estrategia ilustrada por CAP y su sitio de unión ha resultado ser ampliamente utilizada. A medida que se han descubierto más y más proteínas reguladoras del ADN, muchas resultan compartir los rasgos que encontramos en la CAP:

• Por lo general, contienen dos subunidades. Por lo tanto, son dímeros.
• Reconocen y se unen a secuencias de ADN con repeticiones invertidas.
• En bacterias, el reconocimiento y la unión a una secuencia particular de ADN se logra mediante un segmento de hélice alfa. Por lo tanto, estas proteínas a menudo se describen como proteínas hélice-giro-hélice. El represor Trp mostrado arriba es miembro de este grupo.

Ribointerruptores

Los represores proteicos y los corepresores no son la única manera en que las bacterias controlan la transcripción génica. Resulta que la regulación del nivel de ciertos metabolitos también puede ser controlada por ribointerruptores. Un riboswitch es una sección de la región 5' no traducida (5'-UTR) en una molécula de ARN mensajero (ARNm) que tiene un sitio de unión específico para el metabolito (o un pariente cercano). Algunos de los metabolitos que se unen a los ribointerruptores incluyen:

• las purinas adenina y guanina
• los aminoácidos glicina y lisina
• mononucleótido de flavina (el grupo protésico de NADH deshidrogenasa)
• S-adenosilmetionina que dona grupos metilo a muchas moléculas, incluyendo ADN y la tapa en el extremo 5' del ARN mensajero
• ARNt. Cuando estos se unen a su aminoácido (aminoacil-ARNt), se unen al riboswitch en el ARNm que codifica la enzima (una aminoacil-ARNt sintetasa) responsable de cargar el aminoácido en el ARNt. Esto hace que la transcripción del ARNm termine prematuramente. Los ARNt sin aminoácidos unidos también se unen al riboswitch pero de tal manera que la transcripción del ARNm continúa. Su traducción (en bacterias, la traducción comienza mientras la transcripción continúa) produce la aminoacil-ARNt sintetasa utilizada para cargar el aminoácido en el ARNt. Por lo tanto, estos ribointerruptores regulan el nivel de aminoacil-ARNt produciendo más cuando es necesario, menos cuando no (una especie de inhibición por retroalimentación).

En cada caso, el riboswitch regula la transcripción de genes involucrados en el metabolismo de esa molécula. El metabolito se une al ARNm en crecimiento e induce un cambio alostérico que para algunos genes provoca que la síntesis adicional del ARNm termine antes de formar un producto funcional y para otros genes, potencia la finalización de la síntesis del ARNm. En ambos casos, un resultado es controlar el nivel de ese metabolito.

Algunos ribointerruptores controlan la traducción del ARNm en lugar de su transcripción. Se ha sugerido que estos mecanismos reguladores, que no involucran ninguna proteína, son un relicto de un “mundo del ARN”.