9.8: Inmunoprecipitación de cromatina
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- un promotor eucariota generalizado
- múltiples factores de transcripción unidos al promotor Eva de Drosophila
- el receptor de glucocorticoides (proteína) unido a su elemento de respuesta (ADN)
- el represor triptófano unido a su operador
La unión de la proteína al ADN se realiza por fuerzas no covalentes y es fácilmente reversible. De hecho, a medida que cambian las condiciones en una célula, hay un ir y venir dinámico de las proteínas de unión al ADN en todo el genoma. La identificación de un sitio específico en el ADN unido por una proteína particular en un momento determinado se puede descubrir mediante la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP).
El Procedimiento
- Coseche su población celular en el momento deseado. Algunos ejemplos:
- células de levadura que crecen en un nutriente particular;
- células HeLa expuestas a una citocina particular;
- células de las glándulas salivales de Drosophila en el momento de la pupación.
- Tratar las células con formaldehído (HCHO) que crea enlaces covalentes entre las proteínas y los nucleótidos a los que se han unido no covalentemente.
- Romper las células liberando su contenido.
- Use ultrasonido para romper el ADN en fragmentos con un promedio de aproximadamente 500 pb de largo.
- Agrega un anticuerpo que se una específicamente a la proteína que te interesa.
- Agrega perlas recubiertas con Proteína A o Proteína S, ambas proteínas que se unen a cualquier anticuerpo.
- Centrifugar los complejos de perlas—anticuerpo—proteína diana—ADN.
- Calentar los complejos para romper los enlaces covalentes entre la proteína diana y el ADN.
- Digerir la proteína con una proteasa dejando fragmentos de ADN purificados.
- Realizar PCR en los fragmentos.
- Utilizar cualquiera de varios métodos para identificar el ADN amplificado, por ejemplo,
- Southern blotting
- Análisis de chip de ADN (“ChIP on chip”)
- clon y secuencia (“Chip-seq”)