11.1: ADN recombinante y clonación génica
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Elaboración de ADN recombinante (ADNr) - Una visión general
- Tratar el ADN de ambas fuentes con la misma endonucleasa de restricción (BamHI en este caso).
- BamHI corta el mismo sitio en ambas moléculas
5' GGATCC 3'
3' CCTAGG 5'
- Los extremos del corte tienen una pieza saliente de ADN monocatenario.
- Estos se llaman “extremos pegajosos” porque son capaces de emparejarse con cualquier molécula de ADN que contenga el extremo pegajoso complementario.
- En este caso, ambas preparaciones de ADN tienen extremos pegajosos complementarios y así pueden emparejarse entre sí cuando se mezclan.
- Una ADN ligasa une covalentemente los dos en una molécula de ADN recombinante.
Para ser útil, la molécula recombinante debe replicarse muchas veces para proporcionar material para análisis, secuenciación, etc. La producción de muchas copias idénticas de la misma molécula recombinante se llama clonación. La clonación se puede hacer in vitro, mediante un proceso llamado reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aquí, sin embargo, examinaremos cómo se realiza la clonación in vivo.
La clonación in vivo se puede hacer en
- microbios unicelulares como E. coli
- eucariotas unicelulares como levadura y
- en células de mamíferos cultivadas en cultivo tisular.
En todos los casos, el ADN recombinante debe ser captado por la célula en una forma en la que pueda replicarse y expresarse. Esto se logra incorporando el ADN en un vector. Varios virus (tanto bacterianos como de células de mamíferos) pueden servir como vectores. Pero aquí examinemos un ejemplo de clonación usando E. coli como huésped y un plásmido como vector.
Plásmidos
Los plásmidos son pequeños (unos pocos miles de pares de bases), generalmente portan solo uno o unos pocos genes, son circulares y tienen un único origen de replicación. Los plásmidos son replicados por la misma maquinaria que replica el cromosoma bacteriano. Algunos plásmidos se copian aproximadamente a la misma velocidad que el cromosoma, por lo que una sola célula es apta para tener una sola copia del plásmido. Otros plásmidos se copian a una tasa alta y una sola célula puede tener 50 o más de ellos.
Los genes en plásmidos con alto número de copias generalmente se expresan en niveles altos. En la naturaleza, estos genes a menudo codifican proteínas (por ejemplo, enzimas) que protegen a la bacteria de uno o más antibióticos. Los plásmidos ingresan a la célula bacteriana con relativa facilidad. Esto ocurre en la naturaleza y puede explicar la rápida propagación de la resistencia a los antibióticos en hospitales y otros lugares. Los plásmidos se pueden introducir deliberadamente en bacterias en el laboratorio transformando la célula con los genes entrantes.
En la figura anterior, la maraña es una porción de una sola molécula de ADN que contiene más de 4.6 millones de pares de bases que codifican aproximadamente 4.300 genes. Los pequeños círculos son plásmidos.
Ejemplos de plásmidos
PAMP
- 4539 pares de bases
- un único origen de replicación
- un gen (amp r) que confiere resistencia al antibiótico ampicilina (un pariente de penicilina)
- una sola ocurrencia de la secuencia
5' GGATCC 3'
3' CCTAGG 5'que, como vimos anteriormente, es cortado por la enzima de restricción BamHI
- una sola ocurrencia de la secuencia
5' AAGCTT 3'
3' TTCGAA 5'que es cortado por la enzima de restricción HindIII
El tratamiento de PAMP con una mezcla de BamHI y HindIII produce:
- un fragmento de 3755 pares de bases que portan tanto el gen amp r como el origen de replicación
- un fragmento de 784 pares de bases
- ambos fragmentos tienen extremos pegajosos
PKan
- 4207 pares de bases
- un único origen de replicación
- un gen (kan r) que confiere resistencia al antibiótico kanamicina.
- un solo sitio cortado por BamHi
- un solo sitio cortado por HindIII
El tratamiento de pKAN con una mezcla de BamHI y HindIII produce:
- un fragmento de 2332 pares de bases
- un fragmento de 1875 pares de bases con el gen kan r (pero sin origen de replicación)
- ambos fragmentos tienen extremos pegajosos
Estos fragmentos se pueden visualizar sometiendo las mezclas de digestión a electroforesis en un gel de agarosa. Debido a sus grupos fosfato cargados negativamente, el ADN migra hacia el electrodo positivo (ánodo) cuando se aplica una corriente continua. Cuanto más pequeño es el fragmento, más lejos migra en el gel.
Posibilidades de ligadura
Si eliminas las dos enzimas de restricción y proporcionas las condiciones para que la ADN ligasa haga su trabajo, las piezas de estos plásmidos pueden volver a unirse (gracias a la complementariedad de sus extremos pegajosos).
La mezcla de los fragmentos pKan y pAmp proporciona varias (al menos 10) posibilidades de moléculas reunidas. Algunos de estos no producirán plásmidos funcionales (las moléculas con dos o sin origen de replicación no pueden funcionar).
Fig.11.1.4 Plasmido Recombinante
Una posibilidad interesante es la unión de
- el fragmento PAMP de 3755 pb (con amp r y un origen de replicación) con el
- Fragmento pKAN de 1875 pb (con kan r)
Sellado con ADN ligasa, estas moléculas son plásmidos funcionales que son capaces de conferir resistencia tanto a ampicilina como a kanamicina. Son moléculas de ADN recombinante.
Debido a que el origen de replicación, que permite que la molécula funcione como plásmido, fue aportado por pAMP, pAMP se llama vector.
E. coli transformante
El tratamiento de E. coli con la mezcla de moléculas religadas producirá algunas colonias que son capaces de crecer en presencia tanto de ampicilina como de kanamicina.
- Se trata una suspensión de E. coli con la mezcla de moléculas de ADN religadas.
- La suspensión se extiende sobre la superficie de agar que contiene tanto ampicilina como kanamicina.
- Al día siguiente, algunas células —resistentes a ambos antibióticos— habrán crecido hasta convertirse en colonias visibles que contienen miles de millones de células transformadas.
- Cada colonia representa un clon de células transformadas.
Sin embargo, E. coli puede ser transformada simultáneamente por más de un plásmido, por lo que debemos demostrar que las células transformadas han adquirido el plásmido recombinante.
La electroforesis del ADN de colonias doblemente resistentes (clones) cuenta la historia.
- El ADN plasmídico de células que adquirieron su resistencia a partir de un plásmido recombinante solo muestra las bandas de 3755 pb y 1875 pb (clon 1, carril 3).
- El clon 2 (Carril 4) se transformó simultáneamente por pAMP y pKan religados. (No podemos decir si también tomó la molécula recombinante).
- El clon 3 (Carril 5) se transformó por la molécula recombinante así como por un pKAN intacto.
Clonación de otros genes
El vector recombinante descrito anteriormente podría ser por sí mismo una herramienta útil para clonar otros genes. Supongamos que dentro de su gen de resistencia a kanamicina (kan r) hay una sola aparición de la secuencia
5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'
Esta es cortada por la enzima de restricción EcoRI, produciendo extremos pegajosos.
Si tratamos cualquier otra muestra de ADN, por ejemplo, de células humanas, con EcoRI, se formarán fragmentos con los mismos extremos pegajosos. Mezclado con plásmido tratado con EcoRI y ADN ligasa, un pequeño número de moléculas humanas se incorporarán al plásmido que luego se pueden usar para transformar E. coli.
Pero, ¿cómo detectar esos clones de E. coli que han sido transformados por un plásmido que porta una pieza de ADN humano?
La clave es que el sitio EcoRI está dentro del gen kan r, por lo que cuando se inserta allí una pieza de ADN humano, se destruye la función del gen.
Todas las células de E. coli transformadas por el vector, sea portador o no de ADN humano, pueden crecer en presencia de ampicilina. Pero las células de E. coli transformadas por un plásmido que porta ADN humano no podrán crecer en presencia de kanamicina. Entonces,
- Extender una suspensión de E. coli tratada sobre agar que solo contenga ampicilina
- crecer durante la noche
- con un palillo estéril transferir una pequeña cantidad de cada colonia a una mancha identificada en agar que contiene kanamicina
- (hacer lo mismo con otra placa de ampicilina)
- Incubar durante la noche
Todos aquellos clones que continúan creciendo en ampicilina pero que no logran crecer en kanamicina (aquí, los clones 2, 5 y 8) se han transformado con un trozo de ADN humano.
Algunos productos de ADN recombinante que se utilizan en terapia humana
Mediante procedimientos como este, muchos genes humanos han sido clonados en E. coli o en levaduras. Esto ha permitido —por primera vez— producir cantidades ilimitadas de proteínas humanas in vitro. Las células cultivadas (E. coli, levadura, células de mamífero) transformadas con un gen humano están siendo utilizadas para fabricar más de 100 productos para terapia humana. Algunos ejemplos:
- insulina para diabéticos
- factor VIII para hombres que padecen hemofilia A
- factor IX para la hemofilia B
- hormona de crecimiento humano (HGH)
- eritropoyetina (EPO) para tratar la anemia
- varios tipos de interferones
- varias interleucinas
- factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) para estimular la médula ósea después de un trasplante de médula ósea
- factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) para estimular la producción de neutrófilos (por ejemplo, después de la quimioterapia) y para movilizar células madre hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre.
- activador tisular del plasminógeno (TPA) para disolver coágulos sanguíneos
- adenosina desaminasa (ADA) para tratar algunas formas de inmunodeficiencia combinada grave (IDCG)
- hormona paratiroidea
- muchos anticuerpos monoclonales
- antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) para vacunar contra el virus de la hepatitis B
- Inhibidor de C1 (C1INH) utilizado para tratar el angioedema hereditario