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14.2B: Técnicas de Secuenciación de ADN

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    Se utilizan técnicas de secuenciación de ADN para determinar el orden de los nucleótidos (A, T, C, G) en una molécula de ADN.

    Objetivos de aprendizaje
    • Diferenciar entre las técnicas utilizadas para secuenciar ADN

    Puntos Clave

    • La secuenciación del genoma hará avanzar en gran medida nuestra comprensión de la biología genética y tiene un amplio potencial para el diagnóstico y tratamiento médico.
    • Las tecnologías de secuenciación de ADN han pasado por al menos tres “generaciones”: la secuenciación de Sanger y la secuenciación Gilbert fueron de primera generación, la pirosecuenciación fue de segunda generación y la secuenciación de Illumina es de próxima generación.
    • La secuenciación de Sanger se basa en el uso de terminadores de cadena, ddNTPs, que se agregan a las cadenas de ADN en crecimiento y terminan la síntesis en diferentes puntos.
    • La secuenciación de Illumina implica ejecutar hasta 500,000,000 reacciones de secuenciación diferentes simultáneamente en un solo portaobjetos pequeños. Hace uso de una reacción de replicación modificada y utiliza nucleótidos marcados fluorescentemente.
    • La secuenciación escopeta es una técnica para determinar la secuencia de cromosomas completos y genomas completos basada en la producción de fragmentos aleatorios de ADN que luego son ensamblados por computadoras que ordenan fragmentos encontrando extremos superpuestos.

    Términos Clave

    • Secuenciación de ADN: una técnica utilizada en biología molecular que determina la secuencia de nucleótidos (A, C, G y T) en una región particular del ADN
    • didesoxinucleótido: cualquier nucleótido formado a partir de un desoxinucleótido por pérdida de un segundo grupo hidroxilo del grupo desoxirribosa
    • in vitro: cualquier proceso bioquímico realizado fuera de su entorno biológico natural, como en un tubo de ensayo, placa de Petri, etc. (del latín para “en vidrio”)

    Técnicas de secuenciación de ADN

    Si bien las técnicas para secuenciar proteínas han existido desde la década de 1950, las técnicas para secuenciar ADN no se desarrollaron hasta mediados de la década de 1970, cuando se desarrollaron dos métodos de secuenciación distintos casi simultáneamente, uno por el grupo de Walter Gilbert en la Universidad de Harvard y el otro por el grupo de Frederick Sanger en Universidad de Cambridge. Sin embargo, hasta la década de 1990, la secuenciación del ADN era un proceso relativamente costoso y largo. El uso de nucleótidos radiomarcados también agravó el problema a través de preocupaciones de seguridad. Con la tecnología actualmente disponible y las máquinas automatizadas, el proceso es más barato, más seguro y se puede completar en cuestión de horas. El método de secuenciación de Sanger se utilizó para el proyecto de secuenciación del genoma humano, el cual terminó su fase de secuenciación en 2003, pero hoy tanto él como el método Gilbert han sido reemplazados en gran medida por mejores métodos.

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    Figura\(\PageIndex{1}\): Método de Sanger: En el método de terminación de cadena didesoxica de Frederick Sanger, se utilizan didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia para generar fragmentos de ADN que terminan en cada nucleótido a lo largo de la cadena molde. El ADN se separa por electroforesis capilar en base al tamaño. Desde el orden de los fragmentos formados, se puede leer la secuencia de ADN. Los fragmentos más pequeños se terminaron más temprano, y primero salen de la columna, por lo que el orden en que diferentes etiquetas fluorescentes salen de la columna es también la secuencia de la hebra. La lectura de la secuencia de ADN se muestra en un electroferograma que es generado por un escáner láser.

    Secuenciación de Sanger

    El método de Sanger también se conoce como el método de terminación de cadena didesoxi. Este método de secuenciación se basa en el uso de terminadores de cadena, los didesoxinucleótidos (ddNTPs). Los didesoxinucleótidos, o ddNTPSs, difieren de los desoxinucleótidos por la falta de un grupo 3′ OH libre en el azúcar de cinco carbonos. Si se agrega un ddNTP a una cadena de ADN en crecimiento, la cadena no se extiende más porque el grupo OH 3' libre necesario para agregar otro nucleótido no está disponible. Mediante el uso de una proporción predeterminada de desoxirribonucleótidos a didesoxinucleótidos, es posible generar fragmentos de ADN de diferentes tamaños al replicar ADN in vitro.

    Una reacción de secuenciación de Sanger es solo una reacción de replicación de ADN in vitro modificada. Como tal, se necesitan los siguientes componentes: ADN molde (que será el ADN cuya secuencia se determinará), ADN Polimerasa para catalizar las reacciones de replicación, un cebador que pares de bases antes de la porción del ADN que desea secuenciar, dNTPs y ddNTPs. Los ddNTPs son los que distinguen una reacción de secuenciación de Sanger de solo una reacción de replicación. La mayoría de las veces en una reacción de secuenciación de Sanger, la ADN Polimerasa agregará un dNTP adecuado a la cadena en crecimiento que está sintetizando in vitro. Pero en ubicaciones aleatorias, en su lugar agregará un ddNTP. Cuando lo haga, esa hebra se terminará en el ddNTP recién agregado. Si se incluyen suficientes ADN molde en la mezcla de reacción, cada uno tendrá el ddNTP insertado en una ubicación aleatoria diferente, y habrá al menos un ADN terminado en cada nucleótido diferente a lo largo de su longitud durante el tiempo que pueda tener lugar la reacción in vitro (aproximadamente 900 nucleótidos en condiciones óptimas. condiciones.)

    Los ddNTPs que terminan las cadenas tienen etiquetas fluorescentes unidas covalentemente a ellas. Cada uno de los cuatro ddNTPs lleva una etiqueta diferente, por lo que cada ddNTP diferente fluorescerá un color diferente.

    Una vez terminada la reacción, la reacción se somete a electroforesis capilar. Todos los fragmentos recién sintetizados, cada uno terminado en un nucleótido diferente y así cada uno de diferente longitud, están separados por tamaño. A medida que cada fragmento de diferentes tamaños sale de la columna capilar, un láser excita la etiqueta fluorescente en su nucleótido terminal. A partir del color de la fluorescencia resultante, una computadora puede realizar un seguimiento de qué nucleótido estuvo presente como nucleótido terminador. La computadora también realiza un seguimiento del orden en que aparecieron los nucleótidos terminadores, que es la secuencia del ADN utilizado en la reacción original.

    Secuenciación de segunda generación y próxima generación

    Los métodos de secuenciación de ADN de Sanger y Gilbert a menudo se denominan secuenciación de “primera generación” porque fueron los primeros en desarrollarse. A finales de la década de 1990 comenzaron a desarrollarse nuevos métodos, llamados métodos de secuenciación de segunda generación, que eran más rápidos y baratos. El método de secuenciación de segunda generación más popular y ampliamente utilizado fue uno llamado Pirosecuenciación.

    Hoy en día están disponibles varios métodos de secuenciación más nuevos y otros están en proceso de ser desarrollados. Estos a menudo se denominan métodos de secuenciación de próxima generación. El método de secuenciación más utilizado actualmente es uno llamado secuenciación Illumina (por el nombre de la compañía que comercializó la técnica), pero numerosos métodos competidores están en proceso de desarrollo y pueden suplantar la secuenciación Illumina.

    En la secuenciación Illumina, hasta 500,000,000 reacciones de secuenciación separadas se ejecutan simultáneamente en un solo portaobjetos (del tamaño de un portaobjetos de microscopio) colocado en una sola máquina. Cada reacción se analiza por separado y las secuencias generadas a partir de los 500 millones de ADN se almacenan en una computadora conectada. Cada reacción de secuenciación es una reacción de replicación modificada que involucra nucleótidos marcados con fluorescencia, pero no se necesitan didesoxinucleótidos que terminen la cadena.

    Cuando el genoma humano se secuenció por primera vez usando la secuenciación de Sanger, tomó varios años, cientos de laboratorios trabajando juntos y un costo de alrededor de 100 millones de dólares para secuenciarlo hasta casi su finalización. La secuenciación de próxima generación puede secuenciar un genoma de tamaño comparativo en cuestión de días, usando una sola máquina, a un costo de menos de $10,000. Muchos investigadores se han fijado el objetivo de mejorar aún más los métodos de secuenciación hasta que se pueda secuenciar un solo genoma humano por menos de $1000.

    Secuenciación escopeta

    La secuencia de Sanger solo puede producir varios cientos de nucleótidos de secuencia por reacción. La mayoría de las técnicas de secuenciación de próxima generación generan bloques de secuencia aún más pequeños. Los genomas están formados por cromosomas que tienen una longitud de decenas a cientos de millones de pares de bases. Solo se pueden secuenciar en pequeños fragmentos y los fragmentos diminutos tienen que ponerse en el orden correcto para generar la secuencia genómica ininterrumpida. La mayoría de los proyectos de secuenciación genómica hoy en día utilizan un enfoque llamado secuenciación de escopeta de genoma completo

    La secuenciación de escopeta de genoma completo implica aislar muchas copias del ADN cromosómico de interés. Los cromosomas están todos fragmentados en tamaños lo suficientemente pequeños como para ser secuenciados (unos pocos cientos de pares de bases) en ubicaciones aleatorias. Como resultado, cada copia del mismo cromosoma se fragmenta en diferentes ubicaciones y los fragmentos de la misma parte del cromosoma se superpondrán entre sí. Cada fragmento está secuenciado y sofisticados algoritmos informáticos comparan todos los diferentes fragmentos para encontrar cuáles se superponen con cuáles. Al alinear las regiones superpuestas, un proceso llamado ordenamiento en teselas, la computadora puede encontrar las secuencias continuas más grandes posibles que se pueden generar a partir de los fragmentos. En última instancia, se ensambla la secuencia de cromosomas completos.

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    Figura\(\PageIndex{1}\): Secuenciación de escopeta de genoma completo.: En la secuenciación de escopeta, se aíslan múltiples copias del mismo cromosoma y luego se fragmentan en ubicaciones aleatorias. Las diferentes copias del cromosoma terminan generando fragmentos de diferente longitud. Cuando se haya secuenciado la colección completa de fragmentos, la comparación de las secuencias de todos los fragmentos revelará qué fragmentos tienen extremos que se solapan con otros fragmentos. La secuencia completa de un extremo del ADN original al otro se puede ensamblar siguiendo la secuencia desde el primer fragmento solapante hasta el último.

    La secuenciación del genoma hará avanzar en gran medida nuestra comprensión de la biología genética. Tiene un amplio potencial para el diagnóstico y tratamiento médico.

    Contribuciones y Atribuciones

    • Colegio OpenStax, Biología. 16 de octubre de 2013. Proporcionado por: OpenStax CNX. Ubicado en: http://cnx.org/content/m44486/latest...ol11448/latest. Licencia: CC BY: Atribución
    • Secuenciación de ADN. Proporcionado por: Wikipedia. Ubicado en: es.wikipedia.org/wiki/DNA_Sequencing. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • desoxirribosa. Proporcionado por: Wikcionario. Ubicado en: es.wiktionary.org/wiki/desoxirribosa. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • nucleótido. Proporcionado por: Wikcionario. Ubicado en: es.wiktionary.org/wiki/nucleotide. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • data-atribution-url=cnx.org/content/m44486/latest... e_14_02_01.jpg. Proporcionado por: Connexions. Licencia: CC BY: Atribución
    • Colegio OpenStax, Estructura y Secuenciación del ADN. 16 de octubre de 2013. Proporcionado por: OpenStax CNX. Ubicado en: http://cnx.org/content/m44486/latest...4_02_03abc.jpg. Licencia: CC BY: Atribución
    • Bioquímica estructural/Técnicas de ADN recombinante/Secuenciación de ADN. Proporcionado por: Wikilibros. Ubicado en: es.wikibooks.org/wiki/Structu... DNA_secuenciación. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • Bioquímica estructural/Técnicas de ADN recombinante/Secuenciación de ADN. Proporcionado por: Wikilibros. Ubicado en: es.wikibooks.org/wiki/Structu... DNA_secuenciación. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • Colegio OpenStax, Biología. 16 de octubre de 2013. Proporcionado por: OpenStax CNX. Ubicado en: http://cnx.org/content/m44486/latest...ol11448/latest. Licencia: CC BY: Atribución
    • Bioquímica estructural/Técnicas de ADN recombinante/Secuenciación de ADN. Proporcionado por: Wikilibros. Ubicado en: es.wikibooks.org/wiki/Structu... DNA_secuenciación. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • Sin límites. Proporcionado por: Boundless Learning. Ubicado en: www.boundless.com//biología/de... dna-secuenciacion. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • didesoxinucleótidos. Proporcionado por: Wikcionario. Ubicado en: es.wiktionary.org/wiki/didesoxinucleótidos. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • luciferasa. Proporcionado por: Wikcionario. Ubicado en: es.wiktionary.org/wiki/luciferase. Licencia: CC BY-SA: Atribución-CompartirIgual
    • data-atribution-url=cnx.org/content/m44486/latest... e_14_02_01.jpg. Proporcionado por: Connexions. Licencia: CC BY: Atribución
    • Colegio OpenStax, Estructura y Secuenciación del ADN. 16 de octubre de 2013. Proporcionado por: OpenStax CNX. Ubicado en: http://cnx.org/content/m44486/latest...4_02_03abc.jpg. Licencia: CC BY: Atribución
    • Colegio OpenStax, Estructura y Secuenciación del ADN. 16 de octubre de 2013. Proporcionado por: OpenStax CNX. Ubicado en: http://cnx.org/content/m44486/latest...14_02_04ab.jpg. Licencia: CC BY: Atribución

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