17.5B: Técnicas Básicas en Análisis de Proteínas

Objetivos de aprendizaje

• Describir las técnicas utilizadas en proteómica para analizar proteínas

Técnicas Básicas en Análisis de Proteínas

El objetivo final de la proteómica es identificar o comparar las proteínas expresadas en un genoma dado bajo condiciones específicas, estudiar las interacciones entre las proteínas y usar la información para predecir el comportamiento celular o desarrollar dianas farmacológicas. Así como el genoma se analiza utilizando la técnica básica de secuenciación del ADN, la proteómica requiere técnicas para el análisis de proteínas. La técnica básica para el análisis de proteínas, análoga a la secuenciación del ADN, es la espectrometría de masas.

Figura\(\PageIndex{1}\): Espectrómetro de masas: Espectrómetro de masas por desorción láser asistida por matriz — Tiempo de vuelo (MALDI-TOF). La espectrometría de masas se puede utilizar en el análisis de proteínas.

Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas se utiliza para identificar y determinar las características de una molécula. Es una técnica en la que las moléculas en fase gaseosa se ionizan y su relación masa-carga se mide observando diferencias de aceleración de iones cuando se aplica un campo eléctrico. Los iones más ligeros se acelerarán más rápido y se detectarán primero. Si la masa se mide con precisión, entonces se puede identificar la composición de la molécula. En el caso de las proteínas, se puede identificar la secuencia. El reto de las técnicas utilizadas para los análisis proteómicos es la dificultad para detectar pequeñas cantidades de proteínas, pero los avances en espectrometría han permitido a los investigadores analizar muestras muy pequeñas de proteína. Las variaciones en la expresión de proteínas en estados enfermos, sin embargo, pueden ser difíciles de discernir. Las proteínas son moléculas inestables por naturaleza, lo que hace que el análisis proteómico sea mucho más difícil que el análisis genómico.

Cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear

La cristalografía de rayos X permite a los científicos determinar la estructura tridimensional de un cristal de proteína con resolución atómica. Los cristógrafos apuntan rayos X de alta potencia a un pequeño cristal que contiene billones de moléculas idénticas. El cristal dispersa los rayos X sobre un detector electrónico que es del mismo tipo utilizado para capturar imágenes en una cámara digital. Después de cada explosión de rayos X, que dura de unos segundos a varias horas, los investigadores rotan con precisión el cristal ingresando su orientación deseada en la computadora que controla el aparato de rayos X. Esto permite a los científicos capturar en tres dimensiones cómo el cristal dispersa, o difracta, los rayos X. La intensidad de cada rayo difractado se alimenta a una computadora, que utiliza una ecuación matemática para calcular la posición de cada átomo en la molécula cristalizada. El resultado es una imagen digital tridimensional de la molécula.

Figura\(\PageIndex{1}\): Cristalografía de rayos X: Los rayos X que impactan los núcleos atómicos se difractan en un detector.

Otra técnica de imagen de proteínas, la resonancia magnética nuclear (RMN), utiliza las propiedades magnéticas de los átomos para determinar la estructura tridimensional de las proteínas. La espectroscopia de RMN es única en poder revelar la estructura atómica de las macromoléculas en solución, siempre que se pueda obtener una solución altamente concentrada. Esta técnica depende de que ciertos núcleos atómicos sean intrínsecamente magnéticos. El desplazamiento químico de los núcleos depende de su entorno local. Los espines de los núcleos vecinos interactúan entre sí de manera que proporcionan información estructural definitiva que puede ser utilizada para determinar estructuras tridimensionales completas de proteínas.

Microarrays de proteínas y cribado de dos híbridos

También se han utilizado microarrays de proteínas para estudiar las interacciones entre proteínas. Se trata de adaptaciones a gran escala de la pantalla básica de dos híbridos. La premisa detrás del cribado de dos híbridos es que la mayoría de los factores de transcripción eucariotas tienen dominios modulares de activación y unión que aún pueden activar la transcripción incluso cuando se dividen en dos fragmentos separados, siempre que los fragmentos se acerquen entre sí. Generalmente, el factor de transcripción se divide en un dominio de unión a ADN (BD) y un dominio de activación (AD). Una proteína de interés se fusiona genéticamente al BD y otra proteína se fusiona a la EA. Si las dos proteínas de interés se unen entre sí, entonces la BD y la AD también se unirán y activarán un gen informador que señala la interacción de las dos proteínas híbridas.

Figura\(\PageIndex{1}\): Cribado de dos híbridos: Se utiliza el cribado de dos híbridos para determinar si dos proteínas interactúan. En este método, un factor de transcripción se divide en un dominio de unión a ADN (BD) y un dominio de activación (AD). El dominio de unión es capaz de unirse al promotor en ausencia del dominio activador, pero no activa la transcripción. Una proteína llamada cebo se une al BD, y una proteína llamada presa se une a la EA. La transcripción ocurre solo si la presa “atrapa” el cebo.

Western Blot

La transferencia Western, o inmunotransferencia de proteínas, es una técnica que combina electroforesis de proteínas y anticuerpos para detectar proteínas en una muestra. Una transferencia Western es bastante rápida y simple en comparación con las técnicas anteriores y, por lo tanto, puede servir como un ensayo para validar los resultados de otros experimentos. La muestra de proteína se separa primero por electroforesis en gel, luego se transfiere a una membrana de nitrocelulosa u otro tipo de membrana, y finalmente se tiñe con un anticuerpo primario que se une específicamente a la proteína de interés. Un anticuerpo secundario marcado con fluorescente o radiactivo se une al anticuerpo primario y proporciona un medio de detección mediante fotografía o película de rayos X, respectivamente.

Puntos Clave

• La espectrometría de masas es una técnica que es útil para determinar el tamaño de una proteína o complejo proteico.
• La cristalografía de rayos X y la RMN son técnicas útiles para determinar la estructura 3-D de una proteína o complejo proteico.
• Las micromatrices de proteínas son útiles para determinar las interacciones proteína-proteína.

Términos Clave

• micromatriz: cualquiera de varios dispositivos que contienen una matriz bidimensional de pequeñas cantidades de material biológico utilizado para diversos tipos de ensayos
• gen reportero: un gen que los investigadores unen a una secuencia reguladora de otro gen de interés y cuyo producto es fácilmente identificable en ensayos