20.7: Secuenciación del Genoma Completo

Si bien en los últimos años se han registrado avances significativos en las ciencias médicas, los médicos siguen confundidos por algunas enfermedades, y están utilizando la secuenciación del genoma completo para llegar al fondo del problema. La secuenciación del genoma completo es un proceso que determina la secuencia de ADN de un genoma completo. La secuenciación del genoma completo es un enfoque de fuerza bruta para resolver problemas cuando hay una base genética en el núcleo de una enfermedad. Varios laboratorios ahora brindan servicios para secuenciar, analizar e interpretar genomas enteros.

Por ejemplo, la secuenciación del exoma completo es una alternativa de menor costo a la secuenciación del genoma completo. En la secuenciación de exomas, solo se secuencian las regiones codificantes productoras de exones del ADN. En 2010, se utilizó la secuenciación del exoma completo para salvar a un niño cuyos intestinos presentaban múltiples abscesos misteriosos. El niño tuvo varias operaciones de colon sin alivio alguno. Finalmente, se realizó la secuenciación del exoma completo, lo que reveló un defecto en una vía que controla la apoptosis (muerte celular programada). Se utilizó un trasplante de médula ósea para superar este trastorno genético, lo que condujo a una cura para el niño. Fue la primera persona en ser atendida exitosamente con base en un diagnóstico realizado por secuenciación del exoma completo. Hoy en día, la secuenciación del genoma humano está más fácilmente disponible y se puede completar en uno o dos días por alrededor de $1000.

Estrategias utilizadas en proyectos de secuenciación

La técnica básica de secuenciación utilizada en todos los proyectos de secuenciación modernos es el método de terminación de cadena (también conocido como el método didesoxilo), que fue desarrollado por Fred Sanger en la década de 1970. El método de terminación de cadena implica la replicación del ADN de un molde monocatenario con el uso de un cebador y un desoxinucleótidos regulares (dNTP), que es un monómero, o una sola unidad, de ADN. El cebador y dNTP se mezclan con una pequeña proporción de didesoxinucleótidos marcados fluorescentemente (ddNTPs). Los ddNTPs son monómeros a los que les falta un grupo hidroxilo (-OH) en el sitio en el que normalmente se une otro nucleótido para formar una cadena (Figura\(\PageIndex{1}\)).

Figura\(\PageIndex{1}\): Un didesoxinucleótidos es similar en estructura a un desoxinucleótidos, pero le falta el grupo hidroxilo 3' (indicado por la caja). Cuando se incorpora un didesoxinucleótidos a una cadena de ADN, la síntesis de ADN se detiene.

Cada ddNTP está marcado con un color diferente de fluoróforo. Cada vez que se incorpora un ddNTP en la cadena complementaria en crecimiento, termina el proceso de replicación del ADN, lo que da como resultado múltiples cadenas cortas de ADN replicado que terminan cada una en un punto diferente durante la replicación. Cuando la mezcla de reacción se procesa por electroforesis en gel después de ser separada en cadenas simples, las múltiples cadenas de ADN recién replicadas forman una escalera debido a los diferentes tamaños. Debido a que los ddNTPs están marcados fluorescentemente, cada banda en el gel refleja el tamaño de la cadena de ADN y el ddNTP que terminó la reacción. Los diferentes colores de los ddNTPs marcados con fluoróforo ayudan a identificar el ddNTP incorporado en esa posición. La lectura del gel sobre la base del color de cada banda en la escalera produce la secuencia de la hebra plantilla (Figura\(\PageIndex{2}\)).

Figura\(\PageIndex{2}\): Se ilustra el método de terminación de cadena didesoxídica de Frederick Sanger. Usando didesoxinucleótidos, el fragmento de ADN puede terminarse en diferentes puntos. El ADN se separa en función del tamaño, y estas bandas, según el tamaño de los fragmentos, se pueden leer.

Estrategias tempranas: Secuenciación de escopeta y secuenciación de extremos por pares

En el método de secuenciación de escopeta, varias copias de un fragmento de ADN se cortan aleatoriamente en muchas piezas más pequeñas (algo así como lo que sucede con un cartucho de disparo redondo cuando se dispara desde una escopeta). Todos los segmentos se secuencian mediante el método de secuenciación en cadena. Después, con la ayuda de una computadora, se analizan los fragmentos para ver dónde se superponen sus secuencias. Al emparejar secuencias superpuestas al final de cada fragmento, se puede reformar la secuencia de ADN completa. Una secuencia más grande que se ensambla a partir de secuencias más cortas que se superponen se llama cóntigo. Como analogía, considera que alguien tiene cuatro copias de una fotografía de paisaje que nunca antes habías visto y no sabes nada de cómo debería aparecer. Luego, la persona rasga cada fotografía con sus manos, de manera que se presentan piezas de diferentes tamaños a partir de cada copia. Luego, la persona mezcla todas las piezas y te pide que reconstruyas la fotografía. En una de las piezas más pequeñas se ve una montaña. En una pieza más grande, se ve que la misma montaña está detrás de un lago. Un tercer fragmento muestra solo el lago, pero revela que hay una cabaña en la orilla del lago. Por lo tanto, al mirar la información superpuesta en estos tres fragmentos, se sabe que la imagen contiene una montaña detrás de un lago que tiene una cabaña en su orilla. Este es el principio detrás de la reconstrucción de secuencias de ADN completas usando secuenciación de escopeta.

Originalmente, la secuenciación de escopeta solo analizó un extremo de cada fragmento en busca de superposiciones. Esto fue suficiente para secuenciar genomas pequeños. Sin embargo, el deseo de secuenciar genomas más grandes, como el de un ser humano, condujo al desarrollo de una secuenciación de escopeta de doble cañón, más formalmente conocida como secuenciación de pares finales. En la secuenciación de extremos por pares, ambos extremos de cada fragmento se analizan para determinar la superposición. La secuenciación por pares es, por lo tanto, más engorrosa que la secuenciación de escopeta, pero es más fácil reconstruir la secuencia porque hay más información disponible.

Secuenciación de próxima generación

Desde 2005, las técnicas de secuenciación automatizada utilizadas por los laboratorios están bajo el paraguas de la secuenciación de próxima generación, que es un grupo de técnicas automatizadas utilizadas para la secuenciación rápida del ADN. Estos secuenciadores automatizados de bajo costo pueden generar secuencias de cientos de miles o millones de fragmentos cortos (de 25 a 500 pares de bases) en el lapso de un día. Estos secuenciadores utilizan software sofisticado para superar el engorroso proceso de poner todos los fragmentos en orden.

Uso de Secuencias del Genoma Completo de Organismos Modelo

El primer genoma que se secuenció completamente fue de un virus bacteriano, el bacteriófago fx174 (5368 pares de bases); esto lo logró Fred Sanger mediante secuenciación de escopeta. Posteriormente se secuenciaron otros orgánulos y genomas virales. El primer organismo cuyo genoma fue secuenciado fue la bacteria Haemophilus influenzae; esto lo logró Craig Venter en la década de 1980. Aproximadamente 74 laboratorios diferentes colaboraron en la secuenciación del genoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae, la cual comenzó en 1989 y se completó en 1996, debido a que era 60 veces mayor que cualquier otro genoma que se hubiera secuenciado. Para 1997, las secuencias genómicas de dos organismos modelo importantes estaban disponibles: la bacteria Escherichia coli K12 y la levadura Saccharomyces cerevisiae. Ahora se conocen genomas de otros organismos modelo, como el ratón Mus musculus, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, el nematodo Caenorhabditis elegans y los humanos Homo sapiens. Se realiza mucha investigación básica en organismos modelo debido a que la información puede ser aplicada a organismos genéticamente similares. Un organismo modelo es una especie que se estudia como modelo para comprender los procesos biológicos en otras especies representadas por el organismo modelo. Tener genomas enteros secuenciados ayuda con los esfuerzos de investigación en estos organismos modelo. El proceso de adjuntar información biológica a las secuencias génicas se denomina anotación genómica. La anotación de secuencias génicas ayuda con experimentos básicos en biología molecular, como el diseño de cebadores de PCR y dianas de ARN.

Usos de las Secuencias Genómicas

Las micromatrices de ADN son métodos utilizados para detectar la expresión génica mediante el análisis de una matriz de fragmentos de ADN que se fijan a un portaobjetos de vidrio o un chip de silicio para identificar genes activos e identificar secuencias. Casi un millón de anomalías genotípicas se pueden descubrir usando microarrays, mientras que la secuenciación del genoma completo puede proporcionar información sobre los seis mil millones de pares de bases en el genoma humano. Aunque el estudio de las aplicaciones médicas de la secuenciación genómica es interesante, esta disciplina tiende a detenerse en la función anormal de los genes. El conocimiento de todo el genoma permitirá descubrir temprano enfermedades de aparición futura y otros trastornos genéticos, lo que permitirá tomar decisiones más informadas sobre el estilo de vida, la medicación y el tener hijos. La genómica aún está en su infancia, aunque algún día puede convertirse en rutina usar la secuenciación del genoma completo para seleccionar a cada recién nacido para detectar anomalías genéticas.

Además de la enfermedad y la medicina, la genómica puede contribuir al desarrollo de nuevas enzimas que convierten la biomasa en biocombustible, lo que se traduce en una mayor producción de cultivos y combustibles, y un menor costo para el consumidor. Este conocimiento debería permitir mejores métodos de control sobre los microbios que se utilizan en la producción de biocombustibles. La genómica también podría mejorar los métodos utilizados para monitorear el impacto de los contaminantes en los ecosistemas y ayudar a limpiar los contaminantes ambientales. La genómica ha permitido el desarrollo de agroquímicos y farmacéuticos que podrían beneficiar a la ciencia médica y a la agricultura.

Suena genial tener todo el conocimiento que podemos obtener de la secuenciación del genoma completo; sin embargo, los humanos tienen la responsabilidad de usar este conocimiento sabiamente. De lo contrario, podría ser fácil hacer un mal uso del poder de dicho conocimiento, dando lugar a una discriminación basada en la genética de una persona, la ingeniería genética humana y otras preocupaciones éticas. Esta información también podría dar lugar a cuestiones legales relacionadas con la salud y la privacidad.

Referencias

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OpenStax, Biología. OpenStax CNX. enero 2, 2017 https://cnx.org/contents/GFy_h8cu@10...ome-Sequencing