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Fuente: BiochemFFA_7_2.pdf. Todo el libro de texto está disponible gratuitamente de los autores en http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

## Instrucciones para copiar

La única manera de hacer nuevas células es mediante la división de células preexistentes. Los organismos unicelulares experimentan división para producir más células como ellos mismos, mientras que los organismos multicelulares surgen a través de la división de una sola célula, generalmente el óvulo fertilizado. Cada vez que una célula se divide, todo su ADN debe copiarse fielmente para que una copia de esta información pueda transmitirse a la célula hija. Este proceso se llama replicación del ADN. Es el medio por el cual la información genética puede transmitirse a través de generaciones de células, y asegura que cada nueva célula tenga una copia completa del genoma. En la siguiente sección, examinaremos el proceso por el cual se copia completa y con precisión el ADN de una célula.

## Materiales de construcción

¿Cuáles son los ingredientes necesarios para construir una nueva molécula de ADN? Como se señaló anteriormente, la molécula de ADN original o parental sirve como molde. Las nuevas moléculas de ADN se ensamblan a través de cada molde uniendo nucleótidos de ADN libres según lo dirigido por las reglas de emparejamiento de bases, con As frente a Ts y Gs a través de Cs.

Los nucleótidos utilizados en la síntesis de ADN son desoxirribonucleósido trifosfatos o dNTPs. Como se puede deducir de su nombre, dichos nucleótidos tienen un azúcar desoxirribosa y tres fosfatos, además de una de las cuatro bases de ADN, A, T, C o G (Figura 7.10).

Cuando se agregan dNTP a una cadena de ADN en crecimiento, dos de esos fosfatos se escindirán, como se describe más adelante, dejando los nucleótidos en una molécula de ADN con solo un fosfato por nucleótido. Esta reacción es catalizada por enzimas conocidas como ADN polimerasas, que crean enlaces fosfodiéster entre un nucleótido y el siguiente.

## Desafíos

Antes de examinar el proceso real de replicación del ADN, es útil pensar en lo que se necesita para lograr esta tarea con éxito. Considere los desafíos que enfrenta una célula en este proceso:

• El gran número de nucleótidos a copiar es enorme: e.g., en células humanas, del orden de varios miles de millones.
• Se debe desenrollar una molécula de ADN parental de doble hélice para exponer cadenas individuales de ADN que puedan servir como moldes para la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
• El desenrollado debe realizarse sin introducir distorsión topológica en la molécula.
• Las ADN polimerasas no pueden comenzar la síntesis de una nueva cadena de ADN de novo y requieren un OH 3' libre al que pueden agregar desoxinucleótidos.
• Las ADN polimerasas solo pueden extender una cadena en la dirección 5' a 3'. El crecimiento de 5' a 3' de ambas nuevas hebras significa que una de las hebras está hecha en trozos.
• El uso de cebadores de ARN requiere que los nucleótidos de ARN se eliminen y reemplacen con nucleótidos de ADN y se deben unir los fragmentos de ADN resultantes.
• La copia de todo el ADN parental debe ser precisa, para que no se introduzcan mutaciones en el ADN recién hecho.

Figura 7.14 - Replicación de ADN procariota vs. eucariota - Wikipedia, la

## Abordar desafíos

• El gran número de nucleótidos a copiar es enorme: e.g., en células humanas, del orden de varios miles de millones.

Las células, ya sean bacterianas o eucariotas, tienen que replicar todo su ADN antes de que puedan dividirse. En células como la nuestra, la gran cantidad de ADN se descompone en muchos cromosomas, cada uno de los cuales está compuesto por una cadena lineal de ADN (Figura 7.12). En células como las de E. coli, hay un solo cromosoma circular.

En cualquier situación, la replicación del ADN se inicia en sitios llamados orígenes de replicación. Estas son regiones de la molécula de ADN que son reconocidas por proteínas especiales llamadas proteínas iniciadoras que se unen al ADN. En E. coli, los orígenes tienen pequeñas regiones de secuencias ricas en A-T que se “funden” para separar las cadenas, cuando las proteínas iniciadoras se unen al origen o replicación. Como recordará, los pares de bases A-T, que tienen dos enlaces de hidrógeno entre ellos, se rompen más fácilmente que los pares de bases G-C que tienen tres cada uno (Figura 7.15).

• Se debe desenrollar una molécula parental de doble hélice para exponer cadenas individuales de ADN que puedan servir como moldes para la síntesis de nuevas cadenas de ADN.

## Desenrollar

Una vez que se abre una pequeña región del ADN en cada origen de replicación, se debe desenrollar la hélice del ADN para permitir que la replicación continúe. El desenrollamiento de la hélice del ADN requiere la acción de una enzima llamada helicasa.

La helicasa utiliza la energía liberada cuando se hidroliza ATP, para romper los enlaces de hidrógeno entre las bases en el ADN y separar las dos cadenas (Figura 7.17). Tenga en cuenta que una burbuja de replicación está compuesta por dos horquillas de replicación que se “mueven” o se abren, en direcciones opuestas. En cada horquilla de replicación, las cadenas de ADN parentales deben desenrollarse para exponer nuevas secciones de molde monocatenario.

• Este desenrollado debe realizarse sin introducir distorsión topológica en la molécula.

¿Cuál es el efecto de desenrollar una región de la doble hélice? El desenrollado local de la doble hélice causa sobrebobinado (aumento del superbobinado positivo) por delante de la región desenrollada.

El ADN delante de la horquilla de replicación tiene que girar, o se retorcerá sobre sí mismo y detendrá la replicación. Este es un problema importante, no sólo para los cromosomas bacterianos circulares, sino también para los cromosomas eucariotas lineales, que, en principio, podrían rotar para aliviar el estrés causado por el aumento del superenrollamiento.

Topoisomerasas

La razón por la que esto es problemático es que no es posible rotar toda la longitud de un cromosoma, con sus millones de pares de bases, ya que el ADN en la horquilla de replicación se desenrolla. ¿Cómo, entonces, se resuelve este problema? Las enzimas llamadas topoisomerasas pueden aliviar el estrés topológico causado por el “desenrollado” local de los vientos extra de la doble hélice. Hacen esto cortando una o ambas hebras del ADN y permitiendo que las hebras giren una alrededor de la otra para liberar la tensión antes de volver a unir los extremos. En E. coli, la topoisomerasa que realiza esta función se llama girasa.

Proteína de unión a ADN monocatenario

Figura 7.18 - Proteínas en una horquilla de replicación de ADN procariota - Imagen de Martha Baker

• Las ADN polimerasas no pueden comenzar la síntesis de una nueva cadena de ADN de novo y requieren un OH 3' libre al que pueden agregar nucleótidos de ADN.

## Extendiendo la imprimación

La reacción catalizada por la ADN polimerasa se produce a través del ataque nucleófilo del grupo 3'OH al final de una cadena de ácido nucleico sobre el α fosfato del dNTP entrante (Figura 7.21). La hidrólisis inmediata del pirofosfato que se escinde del dNTP entrante impulsa la reacción hacia adelante. La adición secuencial de nuevos nucleótidos en el extremo 3' de la cadena creciente de ADN explica el hecho de que la cadena crece en una dirección 5' a 3'.

• Las ADN polimerasas solo pueden extender una cadena en la dirección 5' a 3'. El crecimiento de 5' a 3' de ambas nuevas hebras significa que una de las hebras está hecha en trozos.

Hetrón principal

Sabemos que las ADN polimerasas solo pueden construir una nueva cadena de ADN en la dirección 5' a 3'. También sabemos que las dos cadenas parentales de ADN son antiparalelas. Esto significa que en cada horquilla de replicación, una nueva hebra, llamada la cadena principal, se puede sintetizar continuamente en la dirección 5' a 3' porque se está haciendo en la misma dirección en la que se está abriendo la horquilla de replicación.

• El uso de cebadores de ARN requiere que los nucleótidos de ARN se eliminen y reemplacen con nucleótidos de ADN.

Eliminación de imprimación

Los pasos descritos anteriormente completan esencialmente el proceso de replicación del ADN. Pero aún queda un tema.

• Asegurar precisión en la copia de tanta información

## Precisión

¿Qué tan precisa es la copia de la información por la ADN polimerasa? Como ustedes saben, los cambios en la secuencia del ADN (mutaciones) pueden cambiar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas y que esto suele ser, aunque no siempre, perjudicial para el funcionamiento del organismo. Cuando se copian miles de millones de bases en el ADN durante la replicación, ¿cómo aseguran las células que el ADN recién sintetizado sea una copia fiel de la información original?

Las ADN polimerasas, como hemos señalado anteriormente funcionan rápido (promediando 50 bases por segundo en células humanas y hasta 200 veces más rápido en E. coli). Sin embargo, tanto las células humanas como las bacterianas parecen replicar su ADN con bastante precisión. Esto se debe a que las ADN polimerasas replicativas tienen una función correctora que permite a la polimerasa detectar cuándo se ha insertado la base incorrecta frente a una cadena molde, retroceder y eliminar la base insertada erróneamente, antes de continuar con la síntesis (Figura 7.24).

Figura 7.24 - Error corregido por ADN polimerasas

Esto es posible porque la mayoría de las ADN polimerasas son enzimas de doble función. Pueden extender una cadena de ADN en virtud de su actividad polimerasa 5' a 3'. Algunas polimerasas como la ADN polimerasa I también pueden eliminar cebadores de ARN en la dirección 5' a 3', aunque esa no es una actividad común de las polimerasas. Muchas polimerasas, sin embargo, tienen la capacidad de retroceder y eliminar la última base insertada debido a que poseen una actividad exonucleasa de 3' a 5'.

La actividad exonucleasa de una ADN polimerasa le permite extirpar una base insertada erróneamente, después de lo cual la actividad polimerasa inserta la base correcta y procede con la extensión de la cadena.

En otras palabras, la ADN polimerasa está monitoreando su propia precisión (también denominada su fidelidad) a medida que produce nuevo ADN, corrigiendo errores inmediatamente antes de pasar a agregar la siguiente base. Este mecanismo, que opera durante la replicación del ADN, corrige muchos errores a medida que ocurren, reduciendo en aproximadamente 100 veces los errores que se cometen cuando se copia el ADN.

Como se señaló anteriormente, tanto las células procariotas como las eucariotas tienen múltiples ADN polimerasas. En E. coli, por ejemplo, la ADN polimerasa III es la principal polimerasa replicativa (también conocida como replicasa) mientras que la ADN polimerasa I es responsable de la reparación del ADN así como de la eliminación de los cebadores de ARN y su reemplazo con nucleótidos de ADN durante la replicación. La ADN polimerasa II juega un papel en el reinicio de la replicación después de que el daño del ADN detiene la replicación, mientras que las ADN polimerasas IV y V son requeridas en la síntesis de trans-lesión, o bypass, lo que permite la replicación más allá de los sitios de daño del ADN.

Polimerasas eucariotas

La enzima alterna entre su actividad polimerizante y su actividad correctora. Cuando un par de bases no emparejado está en el sitio catalítico de la polimerasa, el extremo 3' de la cadena en crecimiento se mueve del sitio de la polimerasa al sitio activo de la exonucleasa (Figura 7.26). El mal apareamiento al final es eliminado por la exonucleasa, seguido de reposicionamiento del extremo 3' en el sitio activo de la polimerasa para continuar la síntesis.

## Terminación de la replicación

En los cromosomas bacterianos circulares, existen secuencias específicas conocidas como sitios terminadores o Ter. Estas son múltiples secuencias cortas que sirven como sitios de terminación, permitiendo que las horquillas de replicación que viajan en sentido horario y antihorario a través del cromosoma circular se encuentren en uno de los sitios.

La unión de una proteína, Tus, en un sitio Ter impide un mayor movimiento de la horquilla de replicación y termina la replicación. El ADN parental y circular recién hecho están, en este punto topológicamente entrelazados y deben separarse con la ayuda de la topoisomerasa.

El problema de replicación final

Telómeros

¿Qué efecto tiene en las células la pérdida de secuencia de los extremos de los cromosomas? Sabemos que los extremos de los cromosomas se caracterizan por estructuras llamadas telómeros (Figura 7.28). Los telómeros están formados por muchas copias de secuencias cortas repetidas (en humanos, la repetición es TTAGGG) y proteínas especiales que se unen específicamente a estas secuencias. Esta estructura de los telómeros es útil para distinguir los extremos de los cromosomas de las roturas bicatenarias en el ADN, evitando así que los mecanismos de reparación del ADN en las células se unan a los cromosomas de extremo a extremo.

La otra ventaja de las secuencias repetidas, que no codifican proteínas, es que perder algunas de las repeticiones no conduce a la pérdida de información importante de codificación. Así, las repeticiones actúan como una especie de zona tampón, donde la pérdida de secuencia no condena a la célula. Sin embargo, el acortamiento de los cromosomas no puede continuar indefinidamente. Después de cierto número de ciclos de replicación, se sabe que las células dejan de dividirse y entran en un estado conocido como senescencia replicativa. Esto sugiere que el acortamiento de los telómeros sirve como una especie de reloj, con el grado de contracción de los cromosomas sirviendo como medida del envejecimiento. Eventualmente las células que entran en senescencia morirán.

Figura 7.28 - Cromosomas con telómeros marcados en blanco

Problemas con la pérdida de secuencia

Incluso si nuestras células son capaces de funcionar con cromosomas más cortos durante nuestras vidas, esto nos deja con otro problema. Si nuestros cromosomas se acortan con la edad, entonces presumiblemente nuestros hijos, que heredan nuestros cromosomas, nacerán con cromosomas más cortos de los que empezamos. Ellos, a su vez, harían que sus cromosomas se encogieran a medida que crecían, y sus hijos tendrían cromosomas aún más cortos. En el transcurso de múltiples generaciones, esto llevaría al punto en que una mayor contracción cromosómica daría como resultado células que entrarían en senescencia muy temprano en la vida y morirían poco después. Esto obviamente no sucede. Generación tras generación de niños nacen con cromosomas de longitud completa, por lo que existe un mecanismo que debe asegurar que al menos en las células reproductivas, los cromosomas no se acorten.

Figura 7.29 - La replicación de un cromosoma lineal da como resultado la pérdida de secuencias en los extremos con cada ronda de replicación

Telomerasa

¿Cómo se puede resolver este problema? Se puede observar a partir de la Figura 7.29 que el extremo de la cadena molde original tiene un saliente 3' corto resultante de la eliminación del cebador de ARN a través de ella. Para rellenar esta región, se necesitaría otro cebador, situado más allá del extremo de la cadena molde. Pero para construir tal imprimación, sería necesario que el voladizo de la plantilla fuera más largo. Si fuera posible alargar la cadena molde, entonces se podría colocar otro cebador frente a su extremo y se podría copiar el extremo de la hebra. Tal extensión de la cadena plantilla es exactamente lo que sucede en nuestras células reproductivas. La cadena molde parental es extendida por la enzima telomerasa, que agrega repeticiones de telómeros y alarga el molde. Veremos en breve cómo logra esa hazaña.

Plantilla de ARN

La telomerasa es una enzima inusual, ya que está compuesta por dos componentes, un ARN y una transcriptasa inversa. Una transcriptasa inversa es una ADN polimerasa dependiente de ARN, una enzima que copia un molde de ARN para producir ADN. El componente de ARN de la telomerasa humana, llamado hTERC, tiene una secuencia que es complementaria a la repetición del telómero, TAGGG. Como se ve en la Figura 7.31, este ARN puede emparejarse por bases con la última repetición del telómero en la cadena de ADN parental, mientras que una porción del ARN permanece desapareada.

Plantilla para extensión

La función de la región no apareada del ARN es servir como molde que se puede utilizar para extender el extremo 3' saliente de la molécula de ADN original. El componente proteico de la telomerasa tiene actividad transcriptasa inversa y puede copiar la secuencia de ARN en ADN. En la telomerasa humana, el componente proteico se conoce como hTERT (transcriptasa inversa de telomerasa). Como se ve en la Figura 7.31 y 7.32, la transcriptasa inversa extiende el saliente 3' original usando el componente de ARN como molde. La telomerasa puede entonces disociarse y repetir el proceso varias veces para agregar muchas repeticiones de la secuencia del telómero.