2.3: Elementos extracromosómicos, plásmidos, marcadores seleccionables

• Incluir un origen de replicación (es decir, la región ORic de E. coli) en una molécula de ADN circular es un mecanismo para tener un elemento extracromosómico en la célula procariota.

Figura 2.3.1: Elemento extracromosómico ORic

• Tal elemento extracromosómico se denomina plásmido, o vector
• El plásmido utiliza la maquinaria de la célula hospedadora (es decir, polimerasas, helicasas, dNTP, etc.) para dirigir la replicación.

Figura 2.3.2: Vector/plásmido

• Sin embargo, dado que el trabajo agregado de replicar el elemento extracromosómico es una carga sobre una célula, será superado por otras células que no contienen el plásmido.
  • Dado que en las células procariotas la segregación de plásmidos es un evento aleatorio, pueden surgir células hijas que no contienen el plásmido y estas crecen más rápido (fuera de competencia) que la célula parental.
  • Es decir, en ausencia de otras presiones, después de un periodo de tiempo la población de células en un cultivo serán las que hayan “perdido” el plásmido.

Figura 2.3.3: Pérdida de plásmido

• En organismos con más de un cromosoma (eucariotas) hay una variedad de mecanismos para asegurar que se produzca la segregación adecuada de los cromosomas, es decir, para asegurarse de que las células hijas contengan el mismo número de todos los cromosomas.

• Un mecanismo básico es que cada cromosoma contiene genes esenciales, y si estos se pierden, la célula no puede sobrevivir.

Farmacorresistencia

• Con mucho, el enfoque más común para el mantenimiento de plásmidos es a través de la incorporación de genes farmacorresistentes.
  • Estos también se conocen como marcadores seleccionables, es decir, podemos seleccionar por su presencia mediante la inclusión de antibióticos en los medios de crecimiento.

Ampicilina

• La ampicilina se une e inhibe una serie de enzimas en la membrana bacteriana que están involucradas en la síntesis de la pared celular gram negativa.
  • Por lo tanto, la replicación celular adecuada no puede ocurrir en presencia de ampicilina.
• El gen de resistencia a ampicilina (amp ^r) codifica una enzima (b -lactamasa) que se secreta en el espacio periplásmico de la bacteria donde cataliza la hidrólisis del anillo b -lactama de la ampicilina.
  • Así, el producto génico del gen amp ^r destruye el antibiótico.
• Con el tiempo, la ampicilina en un medio de cultivo o placa de Petri puede ser sustancialmente destruida por b -lactamasa.
  • Cuando esto ocurre, pueden surgir poblaciones celulares que han “perdido” el plásmido.

Figura 2.3.4: Resistencia a la ampicilina

Tetraciclina

• La tetraciclina se une a una proteína de la subunidad 30S del ribosoma e inhibe la translocación ribosómica a lo largo del ARN mensajero que codifica la proteína (es decir, el fármaco interfiere con la traducción normal o producción de proteínas).
  • El gen de resistencia a tetraciclina (tet ^r) codifica una proteína asociada a la membrana externa de 399 aminoácidos de células gram negativas que impide que el antibiótico ingrese a la célula.
• Así, este gen de resistencia a fármacos no destruye el antibiótico. La presión se mantendrá durante todo el proceso de cultivo celular para mantener el plásmido que contiene el gen resistente a fármacos.

Cloranfenicol

• El cloranfenicol se une a la subunidad ribosómica 50S e inhibe la síntesis de proteínas.
• El gen de resistencia al cloranfenicol (Cm ^r) codifica una proteína conocida en la proteína de gato.
  • La proteína cat es una proteína citosólica tetramérica que, en presencia de acetil coenzima A, cataliza la formación de derivados hidroxil-acetoxi de cloranfenicol que son incapaces de unirse al ribosoma.
  • Al igual que con la ampicilina, el producto del gen Cm ^r destruye el antibiótico.
  • Adicionalmente, la expresión de la proteína de gato está influenciada (regulada por disminución) por la presencia de glucosa en los medios.

Kanamicina y neomicina

• Se une a componentes ribosómicos e inhibe la síntesis de proteínas.
• El gen Kan ^r codifica una proteína que se secreta al espacio periplásmico e interfiere con el transporte de estos antibióticos a la célula.
  • Al igual que la resistencia a la tetraciclina, el gen Kan ^r no destruye el antibiótico.

Colicina E1

• Este es miembro de una clase general de sustancias conocidas como bacteriocinas.
• La colicina E1 provoca cambios letales de membrana en bacterias.
  • El gen de resistencia a fármacos (cea) codifica una proteína que interfiere con la acción de la colicina de manera desconocida.

Plásmidos procariotas

• Además de hacer un plásmido usando la región orIC de E. coli, existe un plásmido de E. coli de origen natural llamado plásmido ColE1.
  • El origen de replicación ColE1 es unidireccional (a diferencia de ORic)
  • La replicación de la región ori ColE1 no requiere las proteínas asociadas (por ejemplo, proteína ADNA) como ORic, (pero sí requiere moléculas de ARN específicas).
• Dependiendo de la región exacta del origen ColE1 que se inserta en una molécula de ADN circular, el elemento extracromosómico se mantendrá con un número de copias “bajo” o “alto”
• El gen rop cerca del origen ColE1 está involucrado en la regulación de la replicación.
  • Si la región ori ColE1 incluye este gen entonces el plásmido se mantiene con un número promedio de copias de 10-30 plásmidos/célula. Esto se considera bajo número de copias.
  • Si la región ori ColE1 no tiene el gen rop, entonces el plásmido resultante se mantiene con un número promedio de copias de 100-200 plásmidos/célula. Esto se considera un tipo de plásmido de alto número de copias.
• Si el plásmido contiene un gen que codifica una proteína (como genes de resistencia a fármacos) el número de copias puede influir en la cantidad de dicha proteína en la célula.

PBr322 (4.36 Kb)

• Uno de los plásmidos de clonación originales.
• Construido por ligadura entre sí:
  • el gen de resistencia a tetraciclina del plásmido pSC101
  • ColE1 y región rop del plásmido ColE1
  • el gen de resistencia a ampicilina del transposón Tn3
• Contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina (marcadores).
• Contiene sitios de restricción únicos dentro y fuera de estos marcadores.
• Contiene región rop cerca de CoE1 ori, por lo tanto, tiene un número de copias bajo (10-30)
• La numeración comienza en el único sitio de restricción EcoR I (GAATTC). La primera 'T' en esta secuencia es el número base “1".

Figura 2.3.5: PBR322

El diagrama plasmídico:

• En el centro está el nombre del plásmido (generalmente comienza con una 'p' minúscula) y el tamaño en pares de bases
• el anillo interno proporciona garrapatas en intervalos de 1 kilobase (Kb) para dar una idea de la ubicación general de partes del plásmido
• las flechas indican genes, marcadores, ori o replicación, promotores, polienlazadores, terminadores de transcripción y otros elementos importantes o funcionales
• el anillo externo generalmente indica la ubicación de sitios de endonucleasa de restricción únicos o de número limitado (generalmente <3). No se indicarán las enzimas de restricción que tengan más de tres sitios. ¡Ten en cuenta que las enzimas que no cortan en absoluto tampoco serán listadas!

PUC18/19 (2.69 Kb)

• Carece del gen rop cerca de la región ori ColE1. Así, este plásmido tiende a acumularse en alto número de copias (100-200).
• Este vector contiene únicamente el marcador de resistencia a ampicilina.
• Este vector contiene una región polienlazadora.
  • Una secuencia de ADN sintética que contiene un agrupamiento de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción únicos
  • Permite insertar fragmentos de ADN, generados por una variedad de escisiones de endonucleasas de restricción, en el plásmido
  • pUC18 tiene el polienlazador en una orientación
  • pUC19 tiene el mismo polienlazador, pero en la orientación opuesta
  • Por lo tanto, los fragmentos con sitios de restricción únicos en cada extremo pueden insertarse en una orientación específica.
  • El sitio Pst I en el gen amp ^r se mutó para eliminarlo. El sitio EcoR I en la posición (1) se mutó para eliminarlo. Esto se hizo para hacer únicos los sitios de restricción en la región polienlazadora.
• Este vector también contiene una región promotora de la transcripción del operón lac, que permite insertar y transcribir/traducir genes extraños.
  • La región polienlazadora está justo aguas abajo (3') del promotor lac.
  • Los genes insertados pueden transcribirse a partir de este promotor

Figura 2.3.6: PUC18/19