2.6: Operón lac; sitio CAP; huella de ADN

El operón lac de E. coli

Figura 2.6.1: Operón lac

• lac Z codifica para b -galactosidasa, que es una enzima que escinde b -galactósidos (por ejemplo lactosa).
• lac Y codifica la permeasa, la cual está involucrada en el transporte de b -galactósidos a la célula.
• lac A codifica b -galactósido transacetilasa, la cual acetila b -galactósidos.

• ^{Una mutación en lac Z o lac Y puede conducir a un genotipo lac, es decir, células que no pueden utilizar b -galactósidos como nutriente.}
• Un mutante lac A-, que carece de actividad transacetilasa, todavía puede utilizar b -galactósidos (todavía es el genotipo lac+). Su papel en el metabolismo de los b galactósidos no está claro.

Promotor

una región de ADN involucrada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

Terminator

una secuencia de ADN que hace que la ARN polimerasa termine la transcripción.

• El grupo de tres genes, lac ZYA, se transcribe en un solo ARNm (mensaje policistrónico) a partir de un promotor justo aguas arriba del gen lac Z.
• En ausencia de un inductor no se transcribe el cúmulo de genes.
• Cuando se añade un inductor (por ejemplo, lactosa, o el análogo no hidrolizable isopropil tiogalactósido - IPTG) la transcripción comienza en un solo promotor (lac P) y avanza a través de los genes lac ZYA a una secuencia terminadora localizada aguas abajo del gen lac A.

Nota

El ARNm de lac ZYA tiene una vida media de ~3 minutos, lo que permite revertir la inducción con relativa rapidez (es decir, las células dejan de producir enzimas rápidamente después de que se detiene la inducción).

Ejercicio 2.6.1

¿Con qué molécula interactúa el inductor (lactosa) para afectar la regulación transcripcional (es decir, la inducción del operón lac)?

Responder

No es b-galactosidasa, permasa o transacetilasa, más bien es una proteína separada llamada proteína represora.

• Los genes lac están controlados por un mecanismo llamado regulación negativa.
  • Esto significa que se transcriben a menos que sean apagados por la proteína reguladora.
  • Una mutación que inactiva la proteína reguladora hace que los genes lac ZYA se expresen continuamente.

Dado que la función de la proteína reguladora es prevenir la expresión, se le llama proteína represora.

Hay dos tipos de genes en el operón lac:

1. Genes estructurales: codifican enzimas requeridas para alguna vía bioquímica (por ejemplo, lac Z, Y y A).
2. Genes reguladores: codifican proteínas involucradas en la regulación de genes estructurales.

Las mutaciones en los genes estructurales suelen afectar la función de solo ese gen estructural. Las mutaciones en genes reguladores pueden afectar la expresión de todos los genes estructurales en un operón.

lac I es el gen regulador del operón lac.

• Este gen se localiza justo aguas arriba de la región promotora para los genes estructurales lac.
• El gen lac I tiene su propio promotor (constitutivo) y terminador.
• Hace un mensaje monocistrónico, y codifica para una proteína: la proteína represora lac.

La característica crucial del “circuito de control” lac reside en la característica dual de la proteína represora lac I:

1. Puede prevenir la transcripción
2. Puede reconocer y unir el inductor de molécula pequeña (lactosa o IPTG)

Prevención de la transcripción por el represor lac

• lac represor (activo como proteína tetramérica) se une a una secuencia de ADN llamada operador (región lac O).
  • La región operadora se encuentra entre la región promotora lac (sitio de unión a la ARN polimerasa e iniciación de la transcripción) y el gen lac Z.
  • Los primeros 26 pares de bases del gen lac Z comprenden la región operadora.

Cuando el represor se une a la región operadora, su presencia impide que la ARN polimerasa inicie la transcripción en el promotor.

• No es que la proteína represora “bloquee” el movimiento de la ARN polimerasa a través del gen lac Z.
• La unión al represor y la unión a la ARN polimerasa (al promotor) son mutuamente excluyentes en la región promotor/operador lac (lac PO).

¿Cómo cambia la interacción represor/operador en presencia de la molécula inductora?

• El inductor puede unirse al represor para formar un complejo represor/inductor que ya no se asocia con el operador.
  • La característica clave de esta interacción es que la proteína represora tiene dos sitios de unión, uno para el inductor y otro para el operador.
  • Cuando el inductor se une en su sitio, cambia la conformación de la proteína represora de tal manera que el sitio de unión del operador tiene una afinidad muy reducida por la región operadora de ADN.
  • Este tipo de control se llama control alostérico.
  • El resultado es que cuando se agrega el inductor, el represor se convierte en una forma que libera del operador.

Figura 2.6.2: Inductor

El control positivo del operón lac es ejercido por el complejo Camp-Cap

• E. coli prefiere la glucosa sobre otras fuentes de carbono.

Cuando la glucosa ingresa a una célula de E. coli se utiliza directamente sin inducción de nuevas enzimas.

• Cuando E. coli se cultiva con glucosa, si se agrega otro azúcar (por ejemplo lactosa) la inducción de enzimas para utilizar el otro azúcar no ocurre hasta que se agote la glucosa.

• Cuando E. coli carece de glucosa sintetiza un nucleótido inusual: monofosfato de adenosina 3'5' cíclico (AMP cíclico, o AMPc):

Figura 2.6.3: AMPc

1. En bacterias un aumento en el nivel de AMPc parece ser una señal de “alerta” que indica un nivel bajo de glucosa:

Figura 2.6.4: Interacción del nivel de AMPc y operón lac

Dibutyryl AMPc

• un análogo de AMPc que puede pasar a través de la membrana de E. coli y al interior de la célula.
• Si esto se agrega a medios que contienen glucosa y lactosa, resultará en la inducción del operón lac.
• Así, imita el mensaje químico que engaña a la E. coli para responder como si los niveles de glucosa fueran bajos.

• Se han aislado mutantes de E. coli que no pueden ser inducidos a metabolizar ningún azúcar que no sea glucosa. Hubo dos categorías generales de mutantes:

1. Clase I. Defectuoso en la enzima adenilato ciclasa. Estos mutantes son incapaces de producir AMPc incluso cuando la concentración de glucosa es baja.
2. Clase II. Carece de una proteína particular conocida como proteína receptora de AMPc (CRP) o, también conocida como proteína receptora de catabolitos (CRP).

• La transcripción máxima del operón lac requiere la presencia de un complejo cAMP y CRP.
  • El complejo cAMP y CRP se une a una secuencia específica en la región de control lac llamada sitio "CAP”.
  • El sitio CAP está justo aguas arriba del sitio de unión a la ARN polimerasa.
  • Las mutaciones en el sitio CAP que previenen la unión de cAMP- CRP también previenen altos niveles de expresión del operón lac.
• Así, el complejo cAMP unido/CRP activa la transcripción (control positivo), mientras que el represor lac unido inhibe la transcripción (control negativo).
  • El complejo cAMP y CRP tiene afinidad por ADN y ARN pol.
  • Mejora la formación de complejos de ARN pol con la región promotora de ADN.

Inducción del operón lac con análogos de lactosa

• El operón lac puede ser inducido con lactosa
  • b -galactosidasa (producto del gen lac Z) metaboliza la lactosa
  • Cuando se reducen los niveles de lactosa, el operón lac vuelve a ser reprimido por el represor lac (producto del gen lac I)
• Los análogos de lactosa no metabolizados pueden inducir continuamente (es decir, desreprimir) el operón lac
  • isopropil b -tiogalactósido, o IPTG, es un análogo de lactosa no metabolizado

Experimentos de “huella” de ADN

• Si una proteína se une a una región de ADN, puede proteger esa región de ADN de la digestión por dnasa (DNasa I: una endonucleasa en sitios adyacentes a nucleótidos de pirimidina).
  • Un fragmento de ADN puede marcarse en los extremos 5' con ^32P y luego el marcador puede eliminarse preferentemente de un extremo (es decir, el extremo 3' de un gen) mediante una endonucleasa de restricción apropiada.
  • Si este fragmento de ADN, con una etiqueta en un extremo específico, forma un complejo con una proteína de unión al ADN, la proteína protegerá la región de ADN a la que se une de la digestión con DNasa I.
  • La digestión se realiza de manera que quede incompleta, para los fines de esta discusión, imagine que cada molécula de ADN se escinde sólo una vez. Además, el sitio de escisión se elige aleatoriamente de los sitios disponibles.
  • Los fragmentos del ADN, separados y analizados por tamaño (usando electroforesis en gel) después de la digestión indicarán la región protegida:

Figura 2.6.5: huella de ADN

Resultados de experimentos de huellas

lac ADN incubado con proteína AMPc/CaP, o ARN polimerasa, o proteína represora lac I:

Figura 2.6.6: Represor lac con AMPc

La ARN polimerasa interactúa con secuencias promotoras específicas y produce una “huella” sobre una región de ~70 pares de bases.

• Se observó que esta protección era más obvia en una hebra que en la otra (es decir, si la otra hebra estaba marcada los resultados no mostraron tanta protección).
• Esta región de protección de DNasa incluyó sitios en el ADN a partir de los cuales los experimentos de mutagénesis produjeron regulación “ascendente” o regulación “descendente” de la fuerza del promotor.
• Estos puntos “calientes” mutagénicos que afectan a la fuerza del promotor se localizaron en las posiciones -10 o -30 aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (posición +1 en el diagrama anterior):

Figura 2.6.7: Mutaciones de fuerza del promotor

• Los promotores pueden clasificarse según su “fuerza”.
• Esto se refiere a la frecuencia relativa de iniciación de la transcripción (eventos de iniciación transcripcional por minuto), y se relaciona con la afinidad de la ARN polimerasa por la región promotora.
• “Se han caracterizado muchos promotores en E. coli y se ha identificado una secuencia promotora “" consenso "”:”

Figura 2.6.8: Fuerza Promotora Consenso

Nota

El promotor lac es un promotor relativamente débil.

ARN Polimerasa

• La ARN polimerasa de E. coli es una holoenzima compuesta por las subunidades b ', b, a (dímero) y s ⁷⁰.
  • La subunidad s ⁷⁰ es la subunidad que se une a la región promotora, pero es incapaz de iniciar la síntesis de ARN.
  • Después de que la subunidad s ⁷⁰ se une, las otras subunidades se unen formando una ARN polimerasa funcional.
  • Después de que se hayan transcrito aproximadamente 10 pares de bases, las hojas de la subunidad s ⁷⁰ y la polimerasa central continúa.

La Región Operadora de Lac

• La región del operador lac está compuesta por una región de repetición invertida (imperfecta).
• No es sorprendente que las moléculas represivas activas estén compuestas por un homodímero.
  • En la estructura homodímera hay un par de regiones a -hélice que se insertan en surcos principales adyacentes del ADN.
  • La separación es aproximadamente 34 angstroms de distancia.