4.5: Reconocimiento Proteína-Proteína Sondeado Usando un Sistema Activador Transcripcional de Levaduras

Campos, S. y Ok-kyu, S. Naturaleza (1989) 340:245-246

Antecedentes

El genoma de la levadura contiene U pstream A ctivator S ecuencias (UAS)

Los UAS están localizados 5' de la región codificante de un gen y son regiones reguladoras, se unen a proteínas activadoras transcripcionales. Estas proteínas activadoras transcripcionales, cuando se unen a UAS, estimulan la transcripción (es decir, pueden contener sitios de unión para la ARN polimerasa

Gen de levadura, nomenclatura de proteínas

Los genes de tipo silvestre se designan con letras mayúsculas en cursiva (por ejemplo, GAL4). Los alelos mutantes de los genes se indican en cursiva minúscula (por ejemplo, gal4) y las proteínas codificadas se indican por tipo romano, con la primera letra mayúscula (por ejemplo, Gal4)

Crecimiento de levadura en medios que contienen galactosa

La incubación de levadura silvestre en galactosa da como resultado un aumento de >1,000 veces en el nivel de ARNm para las enzimas involucradas en el metabolismo de la galactosa. Este incremento en los niveles de ARNm no se observa en los mutantes gal4. La proteína Gal4 no es una de las enzimas involucradas en el metabolismo de la galactosa, sino que parece ser una proteína activadora transcripcional que activa específicamente la transcripción de genes involucrados en la vía metabólica de la galactosa. La proteína Gal4 se une a una región específica de ADN de 17 nucleótidos de longitud localizada en la región 5' de los genes involucrados en el metabolismo de la galactosa. Estas regiones se denominan UAS _GAL La unión de Gal4 a UAS _GAL aumenta la transcripción del promotor cercano

Proteína Gal4

• Una sola cadena polipeptídica que contiene dos dominios:

Figura 4.5.1: Dominios de proteína Gal4

Estos dominios son funcionalmente separables en la cadena polipeptídica (Figura 4.5.2). El dominio amino-terminal (1-74) por sí mismo puede unirse a secuencias UAS _GAL pero no puede activar la transcripción. El dominio carboxilo-terminal (738-881) contiene la región activadora pero no puede activar la transcripción porque no logra localizarse en la región _GAL de UAS (es decir, cerca de la región promotora)

Figura 4.5.2: Cadena polipeptídica Gal4

Diseño Experimental

Imagina que tenemos dos proteínas (X e Y), que normalmente forman un complejo estable (XY)

Figura 4.5.3: Complejo

Si hacemos una proteína de fusión Gal4 (1-74) - X y una proteína de fusión Y-Gal4 (738-881), podemos formar potencialmente un activador de la transcripción Gal4 funcional (es decir, una región activadora de Gal4 en complejo con una región UAS _GAL

Figura 4.5.4: Formación del activador de la transcripción Gal4

Este complejo de proteínas de fusión puede actuar como un activador transcripcional funcional para las enzimas metabólicas de galactosa

Figura 4.5.5: Complejo proteico que actúa como activador de la transcripción

Para probar esta hipótesis, los autores utilizaron el siguiente sistema

• El complejo proteico involucró a las dos proteínas SNF1 y SNF4. La proteína SNF1 es una proteína quinasa específica de serina-treonina, y se sabe que la proteína SNF4 está asociada físicamente con SNF1 y es esencial para la función
• Se realizaron 5 constructos génicos diferentes que involucraban a Gal4 y SNF1 y SNF4:

Figura 4.5.6: Constructos génicos con Gal4, SNF1, SNF4

• Estas construcciones génicas se insertaron en dos plásmidos de levadura diferentes:
  • Todos los constructos que contenían fusiones amino terminales de GAL4 se colocaron en plásmidos que contenían el gen HIS3 (codificando una enzima biosintética necesaria para la producción del aminoácido histidina).
  • Todos los constructos que contenían fusiones carboxi terminales de GAL4 se colocaron en plásmidos que contenían el gen LEU2 (codificando una enzima biosintética necesaria para la producción del aminoácido leucina)
• Estos plásmidos se insertaron en una levadura huésped (GGY1: :171) que tenía el gen GAL4 eliminado, el gen LACZ eliminado, los genes HIS3 y LEU2 mutados para ser no productivos y que también contenía una fusión del gen GAL1 - LACZ (es decir, un lacZ proteína conducida a partir del promotor GAL1 que tiene un UAS _GAL. Este hospedador es así D GAL4, D LACZ, his3, leu2, GAL1-lacZ.
• Por lo tanto, la presión selectiva para las fusiones GAL4 amino terminales se puede mantener eliminando la histidina en los medios de crecimiento (la levadura se basa en el gen HIS3 en el plásmido para producir histidina)
• Asimismo, la presión selectiva para las fusiones GAL4 carboxi terminales se puede mantener eliminando la leucina en los medios de crecimiento (la levadura se basa en el gen LEU2 en el plásmido para producir leucina)
• El hospedador puede albergar ambos tipos de plásmidos (en cuyo caso los medios carecerían tanto de histidina como de leucina)
• La expresión de los constructos de fusión en el plásmido en realidad está regulada por galactosa. La adición de galactosa da como resultado la expresión de los constructos de fusión. Sin embargo, dado que el huésped es D GAL4, todos los demás genes metabólicos de galactosa (por ejemplo GAL1) no estarán regulados al alza en respuesta a la galactosa añadida.

La presencia de una proteína Gal4 funcional en el huésped de levadura GGY1: :171 dará como resultado lo siguiente:

• Se producirá la expresión de la proteína LacZ (contenida en la fusión del gen GAL1 - LACZ huésped). Así, ante la presencia del sustrato XGAL la colonia de levaduras se volverá azul
• Todos los genes hospedadores que contienen una _GAL de UAS estarán regulados por incremento. Esto incluirá todos los genes de tipo salvaje implicados en el metabolismo de la galactosa (por ejemplo, GAL1)

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Resultados Experimentales

Plasmido	Actividad de LacZ
1. Ninguno	<1
2. GAL4 (1-881)	4,000
3. GAL4 (1-147)	<1
4. GAL4 (1-147) -SNF1	<1
5. SNF4	<1
6. SNF4- GAL4 (768-881)	<1
7. GAL4 (1-147) -SNF1; SNF4- GAL4 (768-881)	180
8. GAL4 (1-147) -SNF1; SNF4	7
9. GAL4 (1-147); SNF4- GAL4 (768-881)	<1

• La proteína Gal4 funcional dio como resultado la expresión del gen GAL1 - LACZ del huésped
• La coexpresión de plásmidos que contienen proteínas de fusión GAL4 (1-147) -SNF1; SNF4- GAL4 (768-881) dio como resultado la expresión del gen GAL1 - LACZ huésped, lo que indica la presencia de proteína Gal4 funcional (es decir, formación compleja de las proteínas de fusión Gal4)
• El nivel de proteína LacZ fue menor, sin embargo, lo que indica que el complejo de proteínas de fusión SFN1- y SFN4-Gal4 fue menos eficiente como activador de la transcripción que la proteína Gal4 de tipo silvestre
• Hubo algún nivel bajo de actividad de la proteína LacZ con el complejo de proteínas GAL4 (1-147) -SNF1; SNF4. Esto sugiere que el SNF4 puede tener alguna afinidad menor por la ARN polimerasa

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Conclusiones

Este método puede resultar útil para identificar proteínas que pueden formar complejos estables (es decir, identificar interacciones proteína:proteína específicas). Por ejemplo, si queremos saber qué proteínas se unen a cierto receptor podemos hacer una proteína de fusión GAL4 (1-147) -receptor y cribar una biblioteca de ADNc para detectar posibles proteínas de unión mediante la construcción de construcciones de fusión cDNA- GAL4 (768-881). Las proteínas de unión potenciales de dicha biblioteca pueden cribarse buscando colonias azules con sustrato XGAL, o seleccionarse cultivando la levadura en medios con galactosa como fuente de carbono.