5.3: Cuantificación de la concentración de proteína

Reseña: la Ley Beer-Lambert

log (1/T) = ε cl = A
T = 1/10 ^A

Valores para ε y l

• La longitud del camino l suele ser en unidades de cm. (Nota: la mayoría de los espectrofotómetros están diseñados para aceptar cubetas de 1 cm de ancho)
• El coeficiente de extinción molar ε tiene unidades de M ^-1 cm ^-1 y es una constante de proporcionalidad que relaciona la absorción de soluciones molares
• El coeficiente de extinción de masa ε ^1% se refiere a la absorbancia de una solución al 1% en masa. Típicamente esto se refiere a una solución acuosa que podemos tomar para tener una densidad de 1000g/L, por lo que una solución acuosa al 1% en masa se referiría a la disolución de 10g/L, o una solución de 10mg/ml de la molécula de interés.
• Dado que la absorbancia de una molécula es una función de la longitud de onda (es decir, la absorción no es igual para cada longitud de onda) el coeficiente de extinción también debe hacer referencia a una longitud de onda. Esto se hace típicamente usando un subíndice:

ε ^1% _280nm = 14.5 g ^-1 L cm ^-1

· En este caso una solución de 10mg/ml de la molécula tendrá una lectura de absorbancia de 14.5 (unidades adimensionales) a l = 280nm (la absorción a otras longitudes de onda puede no conocerse). Las unidades de concentración son g/L, por lo que e tendrá dimensiones de g ^-1 L cm ^-1.

¿Por qué es importante poder cuantificar la concentración de proteínas en una muestra?

Una aplicación importante de la “Biotecnología” es la producción de proteínas como productos comerciales. Dichos productos pueden tener aplicaciones farmacéuticas (por ejemplo, insulina, hormona del crecimiento humana, activador de plasminógeno tisular, eritropoyetina, factor VIII de coagulación sanguínea), aplicaciones industriales (por ejemplo, subtilisina (una enzima en detergentes), 2,5-diceto-D-gluconato reductasa (una enzima en la producción de vitamina C), como materiales (por ejemplo, proteína de seda en textiles, proteína de adhesión de babaculo como pegamento). En estos casos, existen diversos aspectos de la producción exitosa que requieren cuantificación:

• ¿Cuánto de la proteína se puede producir (es decir, cuál es la eficiencia de la producción)?
• Qué tan pura es la proteína que se produce (las aplicaciones industriales pueden requerir 90% de pureza, las aplicaciones farmacéuticas pueden requerir 99.999% de pureza)

Dichas proteínas pueden aislarse de fuentes naturales (por ejemplo, el factor VIII de coagulación de la sangre puede extraerse de sangre humana), o pueden producirse de forma recombinante (por ejemplo, las células bacterianas de E. coli se pueden modificar genéticamente para producir la hormona del crecimiento humana). En ambos casos, puede ser necesario purificar la proteína mediante una serie de etapas de fraccionamiento. Entraremos en más detalles sobre tales pasos de fraccionamiento en una conferencia posterior, pero la idea general es que una mezcla heterogénea de moléculas pueda fraccionarse en base a alguna propiedad física de las moléculas. Las siguientes son propiedades que se pueden utilizar para fraccionar una mezcla heterogénea de biomoléculas:

• Masa molecular (es decir, las moléculas “grandes” se pueden separar de las moléculas “pequeñas”)
• pKa (es decir, las moléculas “ácidas” pueden separarse de las moléculas “básicas”)
• Hidrofobicidad (es decir, las moléculas no polares pueden separarse de las moléculas polares)

Para tales pasos de fraccionamiento que involucran proteínas, necesitamos hacer un seguimiento de cuánto de las proteínas contaminantes entraron en una fracción y cuánto de nuestra proteína deseada entró en la otra fracción. Si bien los detalles son algo más complicados que esta simple descripción, es importante poder cuantificar la concentración de proteína para poder purificar eficazmente una proteína de interés.

Una vez que una proteína es pura, puede ser de considerable interés económico poder cuantificar el rendimiento (y, por lo tanto, poder determinar cuánto cuesta producir una masa de proteína dada). Por ejemplo, la única fuente de hormona de crecimiento humana (para tratar la pequeña estatura) solía ser extraerla de las glándulas pituitarias humanas cosechadas de los cerebros de cadáveres. Baste decir, esto hizo que la proteína fuera extremadamente cara. Además, el aislamiento de tejidos humanos significó que la muestra también podría estar potencialmente contaminada con patógenos humanos (hepatitis, ECJ, SIDA, etc.). Con el advenimiento de la ingeniería genética, la producción de hormona de crecimiento humana por células bacterianas (es decir, E. coli) significó que cantidades relativamente grandes podrían producirse mucho más baratas (y sin amenaza de patógenos humanos).

¿Por qué no solo pesar la proteína?

• La mayoría de las muestras suelen ser cantidades de miligramos o incluso microgramos, no gramos, y por lo tanto, es difícil transferir y medir cantidades tan pequeñas
• El agua está presente en las proteínas, y es extremadamente difícil eliminar toda el agua (algunas moléculas de agua se unen de manera extremadamente fuerte a las proteínas). Así, la medición de masa incluiría algunas aguas, y aumentaría la masa aparente de la proteína

Espectros de absorbancia de moléculas biológicas

Proteínas

Las proteínas no se absorben en la longitud de onda visible a menos que tengan un grupo protésico (por ejemplo, Fe ²⁺) o un aminoácido no natural. Sin embargo, los aminoácidos triptófano, tirosina y cisteína absorben la luz en la longitud de onda UV:

Figura 5.3.1: Absorción de triptófano

• El triptófano tiene un pico de absorción a 280 nm en el rango UV
• Esta es una longitud de onda útil para cuantificar la absorción de triptófano
• Dado que la absorción es proporcional a la concentración, esta es una forma útil de cuantificar la concentración de proteínas (para proteínas que contienen Trp)

Ácidos nucleicos

Los anillos aromáticos en las bases de los ácidos nucleicos también absorben en el rango UV:

Figura 5.3.2: Absorción de dAMP

• Cada base de ADN y ARN tiene un espectro de absorción ligeramente diferente
• 260 o 280 nm es una longitud de onda típicamente útil para monitorear la concentración de ácidos nucleicos

Obsérvese que las muestras de ácidos nucleicos y proteínas pueden absorber ambos a 280 nm, por lo tanto, las muestras de moléculas biológicas deben ser puras para cuantificar mediante espectroscopia de absorción UV (cualquier ácido nucleico contaminante en una muestra de proteína aumentará la absorbancia aparente, así mismo para proteínas contaminantes en una muestra de ácido nucleico).

Aspectos importantes de la cuantificación de proteínas mediante absorbancia UV

• Si una proteína contiene residuos Trp, Tyr o Cys se absorberá en la UV. Si no contiene estos aminoácidos, no absorberá la luz UV, y no podemos cuantificarla usando este método
• Múltiples residuos de Trp, Tyr o Cys contribuirán al coeficiente de extinción de la proteína. Así, necesitamos saber cuántos de estos residuos están presentes en la proteína para conocer el coeficiente de extinción correcto
• Los ácidos nucleicos (ADN, ARN) contaminante también absorberán la luz UV, al igual que otras proteínas con residuos Trp, Tyr y Cys. Así, la muestra debe ser PURA para usar absorción UV para cuantificar una proteína

Coeficientes de extinción molar de los aminoácidos Trp, Tyr y Cys:

Aminoácido	E 280nm (M ^-1 cm ^-1)
Trp	5690
Tyr	1280
Cys	120

Ejemplo 5.3.1: Insulina bovina

La insulina bovina contiene 4 residuos Tyr, 6 residuos Cys y 0 residuos Trp. Podemos determinar el coeficiente de extinción molar esperado a 280nm, E _280nm, mediante el siguiente cálculo:

E _280nm = (0) (5690) + (4) (1280) + (6) (120)

E _280nm = 5840 M ^-1 cm ^-1

Así, una solución 1.0M de insulina bovina pura daría una absorbancia de 5,840 a 280nm (obviamente, tendría que diluirse considerablemente para ser leída con precisión).

Una expresión útil que relaciona los parámetros de E, concentración (C) y A se deriva de la ley Beer-Lambert (suponiendo una longitud de ruta de 1 cm):

A/E = C

Por ejemplo, si se observara una muestra de insulina bovina para dar una absorbancia a 280nm de 0.745 podríamos calcular la concentración para ser:

0.745/5840 M ^-1 cm ^-1 = C

C = 1.28 x 10 ^-4 M (nota: cm ^-1 cae con 1 cm de longitud de trayectoria)

Cabe señalar que se requiere una lámpara de deuterio para espectrofotometría UV, así como cubetas de cuarzo (ya que el vidrio absorbe la luz UV)

Métodos colorimétricos (cromogénicos) de determinación de la concentración de proteínas

Cromo significa color y génesis significa creación, por lo que cromogénico significa la “creación de color”. Color significa color (duh...) y métricos medios a medir, por lo que colorimétrico es “medir el color”. Ambos términos se refieren al mismo tipo de cosas en el presente caso: podemos modificar la muestra de proteína con reactivos apropiados para producir una reacción de color (en espectro visible) y medir la concentración de proteínas usando un espectrofotómetro VIS. Las ventajas son:

• Lámpara barata! (bombilla de tungsteno versus deuterio para UV)
• ¡Cubeta barata! (vidrio barato o plástico versus cuarzo)
• ¡No contaminar la absorbancia de proteínas o ácidos nucleicos! (sin absorción en el espectro VIS)

Consideraremos tres métodos: Los métodos Biuret, Lowry y Bradford de determinación colorimétrica de proteínas.

Biuret

Bajo condiciones de pH alto (alcalinas) se cree que el ion cobre II (Cu ²⁺) forma un complejo con nitrógenos peptídicos de proteínas:

Fiugre 5.3.3: Complejo de Cu ²⁺

Este complejo absorbe la luz a 550 nm y tiene las siguientes propiedades útiles:

• Depende de al menos una estructura dipeptídica (ver arriba), por lo tanto, los aminoácidos contaminantes no contribuirán a la absorción de 550 nm
• La unión depende del nitrógeno del esqueleto peptídico y no del grupo funcional de la cadena lateral. Por lo tanto, la unión es independiente de la secuencia
• Los ácidos nucleicos no interfieren ya que no comparten la estructura del esqueleto peptídico
• Sin embargo, el amoníaco y ciertas aminas pueden interferir. Así, las sales de sulfato de amonio y el tampón biológico común TRIS (tris hidroximetil amino etano) proporcionarán un falso positivo y no pueden estar presentes en la muestra
• Además, la absorbción es relativamente débil, por lo tanto, el método es algo insensible y requiere una concentración relativamente alta de proteína

Lowry

El método Lowry es una modificación del método Biuret. Después del tratamiento con Cobre II, la proteína se trata con ácidos mixtos fosfomolibdotungstato (compuestos ácidos de molibdeno e iones tungsteno). Estos ácidos son conocidos como el reactivo Folin-Ciocalteu (o simplemente Folin). El reactivo Folin se agrega en condiciones alcalinas, y el reactivo Folin se reduce posteriormente por los iones Cobre así como las cadenas laterales Tyr, Trp y aminoácidos polares. El producto de esta reacción es el azul de heteropolimolibdeno, que absorbe fuertemente a 750nm. Este ensayo tiene las siguientes propiedades:

• Más sensible que el ensayo de Biuret (puede detectar concentraciones más bajas de proteína)
• Algo dependiente de la composición de aminoácidos (es decir, concentraciones relativas de Tyr, Trp y aminoácidos polares)
• La reacción de absobción depende linealmente de la concentración de proteína, pero solo a bajas concentraciones de proteína (es decir, la curva estándar y el ensayo deben realizarse a un régimen de concentración baja).
• Sensibles a contaminantes como con el método Biuret, así como otros relacionados con el reactivo Folin y reacciones redox.
• Más crítico para el tiempo y la precisión de la persona que realiza el ensayo

Bradford

Un tinte conocido como Coomassie Brilliant Blue fue desarrollado por la industria textil. Se notó manchar la piel así como los textiles. Por lo tanto, se sabía que este colorante (que normalmente absorbe a 465 nm) se une a proteínas y absorbe fuertemente a 595 nm. El colorante forma una amplia variedad de interacciones fuertes, pero no covalentes, incluyendo interacciones donador y aceptor de enlaces de hidrógeno, así como interacciones hidrófobas (no polares).

Figura 5.3.4: Encuadernación azul brillante de Coomassie

El método es bastante sencillo: una sola etapa en la que se agrega el colorante a la solución proteica en condiciones ácidas, y luego se lee la absorbancia a 595nm. Sin embargo, el método tiene las siguientes propiedades:

• La respuesta es generalmente independiente de la composición de aminoácidos.
• El ensayo es sensible, pero algo no lineal. Por lo tanto, siempre se debe realizar una curva estándar (usando concentraciones conocidas de proteína pura)
• El tinte mancha prácticamente todo, incluyendo cubetas, pisos, encimeras. Puede ser un verdadero desastre si se derrama (lo sé por experiencia personal). Y como es un tinte textil, si lo pones en tu ropa, necesitarás aprender a que te gusten los lunares azules.