5.4: Cromatografía

“Croma” se refiere al color y “grafía” se refiere a la escritura.

La cromatografía implica la separación física de una mezcla de compuestos, donde históricamente la identificación de los compuestos individuales es por su color único. La cromatografía puede ser utilizada como método de purificación (escala preparativa) y también para la identificación de compuestos en función de su comportamiento cromatográfico (escala analítica).

Hay muchos tipos de cromatografía, pero todos implican disolver los compuestos a separar en una solución líquida (la fase “móvil”) y luego pasar esta solución a través (o a través de) algún soporte sólido (o “matriz”) conocido como la fase “estacionaria”. La fase estacionaria es típicamente una suspensión de perlas sólidas de sílice o compuestos polisacáridos, o una superficie sólida de estos compuestos. A medida que la fase móvil viaja a través o a través de la fase sólida, los solutos disueltos interactúan en diversos grados con la fase estacionaria (es decir, fuerzas de atracción no covalentes). Cuanto más fuerte es la atracción, más retardan las moléculas en comparación con la fase móvil. Si no hay atracción por el soporte sólido, entonces las moléculas de soluto se mueven con la fase móvil. Las diferentes tasas de movimiento para los diferentes solutos dan como resultado su separación entre sí.

Un ejemplo que puedes hacer en casa involucra un filtro de café (fase estacionaria) y agua (fase móvil) en la separación y análisis del tinte en un rotulador soluble en agua (la mezcla de compuestos). Si dibujas una línea con un marcador púrpura en una tira del papel de filtro, y colocas el fondo en un plato de agua, el agua absorberá el papel, y la afinidad diferencial de las tintas de tinte por el soporte sólido (celulosa) da como resultado una migración diferencial. En el siguiente ejemplo, la tinta roja tiene cierta afinidad por el papel, pero la tinta azul no (y migra con el borde frontal de la fase móvil).

Figura 5.4.1: Cromatografía de pluma púrpura

La cromatografía en bioquímica normalmente no utiliza papel, sino perlas de polisacárido (a menudo químicamente derivatizadas) empaquetadas en una columna, como soporte sólido. El soporte sólido a menudo se llama la cromatografía “resina”. Algunos tipos comunes de resinas cromatográficas incluyen:

• Intercambio iónico
• Afinidad
• hidrofóbico
• Filtración en gel

A menudo, los solutos a separar son proteínas, por lo que la discusión se centrará en la cromatografía de proteínas (pero los principios son los mismos para cualquier soluto)

Intercambio iónico

Las resinas de intercambio iónico contienen grupos cargados.

• Estos pueden ser de naturaleza ácida (en cuyo caso la resina es un intercambiador catiónico)
• o básico (en cuyo caso es un intercambiador aniónico).
• Los intercambiadores catiónicos y aniónicos se pueden descomponer aún más en intercambiadores débiles y fuertes (reflejando la afinidad de unión).

Tipo de intercambiador	Grupo funcional	Nombre común
Intercambiador de cationes débiles	carboximetilo (-)	CM celulosa/sephadex
Intercambiador de cationes fuerte	sulfopropilo (-)	Sephadex SP
Intercambiador aniónico débil	dietilaminoetilo (+)	DE celulosa/sephadex
Intercambiador de aniones fuerte	amina cuaternaria (+)	Sephadex QAE

Por lo general, las muestras se cargan en condiciones de baja fuerza iónica (lo que promueve interacciones electrostáticas) y el material unido se eluye usando una etapa o gradiente de elución de tampón con mayor fuerza iónica.

• En términos generales, una proteína se unirá a una resina de intercambio catiónico si el pH del tampón es menor que el punto isoeléctrico (pI) de la proteína, y se unirá a una resina de intercambio aniónico si el pH es mayor que el pI.
• Por lo tanto, el conocimiento del pI de la proteína es útil para diseñar un protocolo de purificación utilizando resinas de intercambio iónico (sin embargo, siempre puedes probar diferentes resinas para ver cuál funciona mejor).

Elución de proteínas de resinas de intercambio iónico

Las proteínas unidas a resinas de intercambio iónico se unen a través de interacciones iónicas no covalentes (puente salino). Podemos competir por estos sitios de unión iónica en la resina con otros grupos iónicos, a saber, sales

• Existen dos tipos generales de métodos al eluir con una solución salina: 1. Gradiente de elución y 2. Elución por etapas
• Una elución en gradiente se refiere a una transición suave de la concentración de sal (de baja a alta) en el tampón de elución. Las proteínas de unión débil eluyen primero, y las proteínas de unión más fuertes eluyen en último lugar (es decir, requieren mayores concentraciones de sal en el tampón para competir con ellas fuera de la columna)
• Se puede hacer una concentración de sal en gradiente usando un fabricante de gradientes. En su forma más simple, esta consiste en dos contenedores (deben ser de la misma forma) conectados por un sifón (o tubo en la parte inferior). Un recipiente contiene el tampón bajo en sal y el otro contiene tampón alto en sal. El tampón se retira del recipiente bajo en sal:

Figura 5.4.2: Creador de gradientes

• Esto producirá un gradiente lineal de concentraciones bajas a altas de sal sobre el volumen total del gradiente
• Si conocemos el rango de concentración de sal sobre el cual eluirá una proteína de interés, simplemente podemos eluir con un tampón que contenga esa concentración de sal. Esto se conoce como elución escalonada.
• Las eluciones escalonadas son generalmente más rápidas de ejecutar y eluyen la proteína en un volumen global más pequeño que con las eluciones en gradiente. Por lo general, funcionan mejor cuando los contaminantes eluyen a una concentración de sal significativamente diferente a la proteína de interés

Tenga en cuenta que después de la cromatografía de intercambio iónico la proteína de interés estará en un tampón con una concentración potencialmente alta de sal. Esto debe tenerse en cuenta antes de continuar con el siguiente paso en el esquema de purificación

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es un término general que se aplica a una amplia gama de medios cromatográficos. Básicamente puede pensarse como alguna resina inerte a la que se le ha unido algún compuesto que tenga una afinidad específica por su proteína de interés.

• Así, un anticuerpo específico unido a una resina inerte sería un tipo de cromatografía de afinidad.
• Otros ejemplos podrían incluir: un inhibidor de proteasa unido a alguna matriz, diseñado para unirse a una proteasa específica
• un cofactor unido a alguna matriz, diseñado para unirse a una enzima particular
• un ion metálico unido a una matriz, diseñado para quelar una proteína con un sitio de unión a metal, y así sucesivamente.

En cada caso, el tipo de resinas utilizadas y el método de unión pueden variar, al igual que el método de elución. Una generalización con respecto al método de elución es que el ligando unido puede competir fuera del grupo funcional de la columna incluyendo en el tampón de elución una alta concentración del grupo funcional libre. Por ejemplo, si el grupo funcional de la columna es un cofactor, entonces la proteína unida puede competir fuera de la columna pasando un tampón que contiene una alta concentración de cofactor (o análogo de cofactor) a través de la columna.

Otros métodos de elución incluyen cambiar las condiciones del tampón de manera que la proteína ya no esté en el estado nativo (ya que es el estado nativo el que confiere la estructura requerida para la interacción de unión específica). Esto se puede lograr cambiando el pH o añadiendo agentes desnaturalizantes como urea o guanidina.

Con la cromatografía de afinidad, típicamente la purificación lograda en una sola etapa puede ser dramática, del orden de varios miles de veces. Las purificaciones de un solo paso con columnas de afinidad específicas no son inauditas, de hecho es un objetivo ideal de purificación, una matriz que reconoce solo la proteína de interés y ninguna otra.

Resinas hidrófobas

Las resinas hidrófobas contienen un grupo funcional no polar, tal como un alcano o grupo aromático.

• “Muchas proteínas son capaces de secuestrar dichos grupos en su superficie y esta exclusión del disolvente proporciona la base de la energía de unión (es decir, el “" efecto hidrófobo "”).”
• Esta interacción se potencia al aumentar la fuerza iónica, de tal manera que las proteínas pueden unirse en condiciones de alto contenido de sal y eluir en condiciones bajas en sal.
• Como tales, estas columnas pueden usarse no solo para proporcionar purificación, sino para desaltar muestras (por ejemplo después de una precipitación inicial con sulfato de amonio).
• Por lo general, no es posible predecir de antemano qué resina particular se unirá a una proteína dada, esto generalmente se determina empíricamente. Sin embargo, cuanto más largo sea el alcano, o cuanto mayor sea el compuesto aromático, más fuerte será la unión típicamente.

Debido a la naturaleza de las interacciones hidrófobas y la fuerza iónica, la cromatografía hidrofóbica y la cromatografía de intercambio iónico pueden usarse convenientemente secuencialmente. Por ejemplo, después del intercambio iónico la proteína se encuentra en condiciones de alto contenido de sal, por lo que se puede cargar directamente en una columna hidrofóbica. Por el contrario, una columna hidrofóbica se eluye en baja sal, lo que es un requisito para unirse a una resina de intercambio iónico.

Se debe señalar una distinción entre cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de fase inversa

• La cromatografía de interacción hidrofóbica se realiza en condiciones de disolvente acuoso y se utilizan cambios en la fuerza iónica para eluir la columna. La proteína típicamente se une en estado nativo a través de grupos hidrófobos ubicados en la superficie de la proteína. El estado nativo se conserva durante las condiciones de elución
• La cromatografía de fase inversa utiliza un disolvente hidrófobo (típicamente acetonitrilo) y la unión de un ligando es una función de la división de fases entre la naturaleza hidrófoba del disolvente y el grupo funcional de la columna. Las proteínas se desnaturalizan típicamente en tales disolventes y se unen debido a la naturaleza hidrófoba de la secuencia polipeptídica completa. Dado que la mayoría de los grupos hidrófobos están localizados en el núcleo de las proteínas globulares, la unión está relacionada con la desnaturalización de la proteína y la accesibilidad de estos grupos a los grupos funcionales de la columna. Las proteínas pueden purificarse usando cromatografía de fase inversa, pero generalmente deben replegarse de alguna manera para recuperar la funcionalidad (es decir, el estado nativo)

Filtración en gel

La filtración en gel no se basa en ninguna interacción química con la proteína, más bien se basa en una propiedad física de la proteína, que es el radio molecular efectivo (que se relaciona con la masa para la mayoría de las proteínas globulares típicas).

• La resina de filtración en gel se puede considerar como perlas que contienen poros de un rango de tamaño definido.
• Las proteínas grandes que no pueden entrar en estos poros pasan alrededor del exterior de las perlas. Por lo tanto, el volumen de la columna parece menor a una molécula grande.
• Las proteínas más pequeñas que pueden ingresar a los poros de las perlas tienen un volumen mayor que pueden explorar, por lo que el volumen de la columna parece mayor que una molécula pequeña.
• Tanto las moléculas grandes como las pequeñas experimentan el mismo caudal de fase móvil (i.e. L/min) .Así, una muestra de proteínas que pasan a través de una columna de filtración en gel se separará en función del tamaño molecular: las grandes eluirán primero y las más pequeñas eluirán últimas (y “medias” “las proteínas de tamaño se eluirán en el medio).

Figura 5.4.3: Filtración en gel

• Si su proteína es inusualmente “pequeña” o “grande” en comparación con las proteínas contaminantes, entonces la filtración en gel puede funcionar bastante bien.

---

¿Dónde se eluirá una proteína en un experimento de filtración en gel?

• Hay dos extremos en el perfil de separación de una columna de filtración en gel.
• Existe una masa molecular crítica (masa grande) que quedará completamente excluida de las perlas de filtración en gel. Todos los solutos de la muestra que sean iguales o mayores que este tamaño crítico se comportarán de manera idéntica: todos se eluirán en el volumen excluido de la columna
• Existe una masa molecular crítica (masa pequeña) que se incluirá completamente dentro de los poros de las perlas de filtración en gel. Todos los solutos de la muestra que sean iguales o menores que este tamaño crítico se comportarán de manera idéntica: todos se eluirán en el volumen incluido de la columna
• Los solutos entre estos dos rangos de masa molecular eluirán entre los volúmenes excluidos e incluidos

Figura 5.4.4: Elución de proteínas en filtración en gel

Como regla general, el volumen excluido (Vo) es aproximadamente igual a un tercio del volumen de la columna, el volumen incluido es aproximadamente igual a dos tercios del volumen de la columna (el tercio “faltante” es ocupado por el volumen del material de resina).

---

• En la filtración en gel la resolución es una función de la longitud de la columna (cuanto más larga, mejor)
• Sin embargo, un inconveniente está relacionado con el volumen máximo de muestra que se puede cargar. Cuanto mayor sea el volumen de muestra cargado, mayor será el solapamiento entre los picos separados. En términos generales, el tamaño de la muestra que se puede cargar se limita a aproximadamente 3-5% del volumen total de la columna.
• Por lo tanto, la filtración en gel se guarda mejor para las etapas finales de una purificación, cuando la muestra se puede concentrar fácilmente a un pequeño volumen.
• La filtración en gel también se puede utilizar para eliminar sales de la muestra, debido a su capacidad para separar componentes “pequeños” de “grandes”.
• Finalmente, la filtración en gel puede estar entre los métodos de purificación más “suaves” debido a la falta de interacción química con la resina.