5.5: Electroforesis en Gel de Proteínas

La electroforesis en gel se utiliza para caracterizar una de las propiedades más básicas, la masa molecular, tanto de polinucleótidos como de polipéptidos. Aquí nos centraremos exclusivamente en la electroforesis en gel de proteínas

La electroforesis en gel se puede utilizar para determinar:

• la pureza de una muestra de proteína
• heterogeneidad y grado de degradación de una muestra de proteína
• composición de subunidad de una muestra de proteína

¿Cómo funciona?

El principio subyacente de la electroforesis es la propiedad migratoria de especies cargadas dentro de un campo eléctrico. Por lo tanto, es el comportamiento simple de las cargas opuestas que atraen. Se establece un campo eléctrico a través de los electrodos de una fuente de alimentación, y los iones cargados se mueven en este campo eléctrico. Obsérvese que en dicho aparato, la palabra “ANODO” se refiere al electrodo cargado positivamente (el ANODO atrae ANIONES) y la palabra “CATÓDICO” se refiere al electrodo cargado negativamente (el CATÓDICO atrae CATIONS). Los términos cátodo y ánodo son consistentes con sus definiciones de reacción redox en que la reducción se produce posteriormente en el cátodo y la oxidación ocurre en el ánodo:

Figura 5.5.1: Ánodo y cátodo

Advertencia: lee la siguiente nota solo si tienes curiosidad por las baterías y el etiquetado de los electrodos, de lo contrario, no te molestes (puede que solo sea confuso).

Nota

La química redox dentro de la fuente de alimentación externa está impulsando la reacción redox en los electrodos. Tenga en cuenta que los electrones del ánodo van al terminal “+” de la batería. La reducción en este electrodo de la batería debe estar ocurriendo y está impulsando la oxidación en el ánodo de los electrodos externos. Si se está reduciendo este terminal de la batería, entonces debe ser el cátodo en la reacción redox dentro de la batería. Así, las baterías tienen su cátodo etiquetado como “+” y el ánodo etiquetado como “-”. Me tomó horas averiguarlo.

Las proteínas están compuestas por los 20 aminoácidos comunes, que incluyen tanto cadenas laterales cargadas negativamente (es decir, ácidas) (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) como cadenas laterales cargadas positivamente (es decir, básicas) (por ejemplo, histidina, lisina y arginina). Así, las proteínas pueden cargarse, y migrarán en un campo eléctrico.

En este punto hay un par de cosas a considerar:

1) Cualquier separación de este tipo es un proceso de no equilibrio. Con esto, queremos decir que si dejamos que el proceso continúe hasta que se cumpla alguna condición de equilibrio, todos los aniones estarán en un electrodo y todos los cationes estarán en el otro. Sería mejor detener el proceso de separación en algún punto de tiempo intermedio para permitir lograr la separación:

Figura 5.5.2: Proceso de separación

2) El otro problema es que una vez que se apaga el campo eléctrico, la difusión hará que los iones separados se muevan (es decir, perderemos la separación que hemos intentado lograr). Para resolver este problema, la separación no se realiza en solución, sino dentro de una matriz (es decir, una malla molecular o red). La matriz proporciona un componente de fricción que resiste la difusión. Además, la fricción de la matriz es un factor importante en la velocidad de migración de los iones.

3) Obsérvese también que la separación se logra mediante la aplicación inicial de la muestra dentro de una zona estrecha (banda). Si la muestra se dispersa inicialmente, aunque los iones se moverán, no se separarán limpiamente.

Factores que influyen en la tasa de migración de electroforesis (R _f)

Tres factores afectan la tasa de migración:

· Fuerza del campo eléctrico, E (directamente proporcional a la tasa de migración)

· Carga sobre la especie iónica, q (directamente proporcional a la tasa de migración)

· Coeficiente de fricción de la matriz de soporte, f (inversamente proporcional a la tasa de migración)

R _f α Qe/f

Estos factores se pueden variar de la siguiente manera:

· La intensidad del campo es una función de la tensión de la fuente de alimentación. Así, podemos variar el voltaje directamente. En un tema relacionado, el voltaje es proporcional a la resistencia a través de los electrodos. La corriente entra en juego aquí también, pero en definitiva, es difícil lograr un alto voltaje a través de los electrodos si la resistencia es baja. La resistencia de una solución es inversamente proporcional a la fuerza iónica (es decir, concentración de iones). Así, con altas concentraciones de sal, la resistencia es baja, es difícil lograr un alto voltaje y la tasa de migración disminuirá.

· La carga sobre una molécula iónica es una función del pI de la molécula y del pH de la solución

Si pI > pH la molécula es catiónica
(migra hacia el cátodo)

Si pI < pH la molécula es aniónica
(migra hacia el ánodo)

Si pI = pH la molécula es neutra
(sin migración en campo eléctrico)

Por lo tanto, podemos alterar la tasa de migración (y posiblemente la dirección de la migración) alterando el pH de la solución

· El coeficiente de fricción de la matriz puede ser potencialmente alterado. La matriz es típicamente una red polimérica (véase más adelante), denominada gel, y el coeficiente de fricción puede aumentarse aumentando la concentración de polímero.

La matriz de gel para electroforesis en gel de proteínas

La electroforesis en gel de proteínas utiliza casi exclusivamente poliacrilamida. Este es un polímero compuesto por dos componentes unidos de forma covalentía:

• acrilamida
• bis acrilamida.

La bis acrilamida es esencialmente un componente reticulante del polímero de acrilamida. Un valor típico para la relación acrilamida:bisratio es 19:1 y la concentración total de acrilamida en el gel afecta la migración de proteínas a través de la matriz (es decir, determina el coeficiente de fricción).

• Las proteínas de alta masa molecular se separan usando bajo coeficiente de fricción (es decir, bajas concentraciones) de poliacrilamida.
• Las proteínas de baja masa molecular se separan usando alto coeficiente de fricción (es decir, altas concentraciones) de poliacrilamida.

• Aunque ahora tenemos todo en su lugar para realizar un experimento de electroforesis en gel para separar proteínas, hay otra consideración que a menudo es indeseable (aunque a veces útil). Esta situación es el hecho de que diferentes proteínas tienen diferentes cargas para un valor dado de pH. Así, las proteínas migrarán en función tanto de su masa (las grandes se mueven lentamente) como de su carga neta general.
• Si hubiera alguna manera de hacer que cada proteína tuviera una relación carga a masa idéntica, podríamos separar una mezcla de proteínas basada solo en los efectos de masa

El papel del detergente dodecilsulfato de sodio en la electroforesis en gel de poliacrilamida

El dodecil sulfato de sodio (SDS; también conocido como “sulfato de laurel”) es un detergente iónico con la siguiente estructura:

Figura 5.5.3: Estructura de sulfato de laurel de sodio

• El SDS se une, a través de interacciones hidrofóbicas, a las proteínas en una estequiometría aproximadamente proporcional al tamaño de la proteína (es decir, una proteína pequeña se unirá a algunas moléculas, y una proteína grande se unirá a muchas moléculas de SDS)
• Debido a la naturaleza cargada de la molécula SDS, las proteínas tendrán así una relación de carga a masa constante aproximada debido a la carga proporcionada por la SDS, y migrarán a través del gel a una velocidad proporcional a su masa molecular.
• Las proteínas migran hacia el ánodo ya que la carga en el SDS es negativa en todas las condiciones de pH excepto altamente ácidas.

Los geles proteicos generalmente se realizan bajo condiciones desnaturalizantes, lo que significa que la preparación de la muestra implica calentar la proteína en presencia de SDS para desplegar completamente la proteína y permitir la unión de SDS a lo largo de la longitud del polipéptido. Una vez que se ha unido el SDS, los valores de pI característicos de las proteínas ya no son relevantes; la proteína adquiere una carga negativa, y cada proteína tiene esencialmente la misma relación carga a masa.

Tasa de migración, masa proteica y el% de acrilamida en el gel

Cuanto mayor sea el porcentaje de acrilamida en el soporte de gel, mayor será el coeficiente de fricción y más lenta será la tasa de migración. Si las proteínas a separar son de una masa molecular alta, y si el% de gel es alto, es posible que las proteínas ni siquiera entren en el gel (debido a la fricción abrumadora). Por lo tanto, es esencial hacer coincidir el% de gel con la masa de las proteínas que se están separando. La siguiente tabla proporciona una guía general:

Acrilina	Rango de separación de polipéptidos (longitud en aminoácidos)
8%	25-200 kDa (225-1800 a.a.)
10%	15-100 kDa (135-900 a.a.)
12.5%	10-70 kDa (90-630 a.a.)
15%	6-60 kDa (55-550 a.a.)
20%	4-40 kDa (36-360)

Al configurar el experimento SDS PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio) necesitamos saber cuándo detener el experimento (ya que no es un proceso de equilibrio). Esto es algo difícil de determinar ya que las proteínas (incluso con SDS unido) no absorben en el espectro visible (es decir, no podemos simplemente mirar el gel para determinar cuándo se han separado las proteínas). Por lo tanto, es común incluir en la muestra de proteína una pequeña molécula de colorante aniónico (por ejemplo, azul de bromofenol):

• El tamaño de la molécula de colorante se elige para que sea muy pequeño para que esencialmente no haya coeficiente de fricción con el gel
• El colorante se elige para que sea aniónico de manera que migre en la misma dirección que los complejos proteína/SDS (es decir, hacia el ánodo).
• Dado que el tinte es aniónico, y pequeño, migrará el más rápido de cualquier componente en la mezcla a separar
• La molécula de colorante también se elige de manera que se absorba en el espectro visible (y, por lo tanto, sea detectable visualmente mientras el gel está funcionando)
• La mezcla de proteína/SDS/tinte se carga en la parte superior del gel (es decir, el lado del cátodo) y cuando la molécula de tinte (el “frente de tinte”) llega al fondo del gel, la energía se apaga y el experimento se detiene.

Visualización de las proteínas separadas

Aunque el soporte de gel proporciona cierta fricción a los movimientos moleculares, tan pronto como se apague la energía las bandas de proteínas separadas comenzarán a difundirse (son libremente solubles en solución acuosa). Para evitar esto, el gel se trata con una solución de ácido acético y metanol lo que hace que casi todas las proteínas precipiten (se vuelvan insolubles). A esto se le llama “fijar” el gel. Ahora las proteínas separadas no se difundirán.

Sin embargo, las proteínas fijadas siguen siendo invisibles y deben visualizarse mediante tinción. Una tinción de proteína común es Coomassie Brilliant Blue R-250 (relacionada con el tinte utilizado anteriormente en el ensayo de Bradford). El gel fijado se incuba en una solución de “Coomassiestain” y luego la mancha se lava del gel mediante incubación en una solución débil de ácido acético y metanol. La mancha no se unirá a la acrilamida, y se lavará (dejando un gel transparente). Sin embargo, permanece fuertemente unida a las proteínas en el gel, y estas toman un color azul profundo.

Determinación de la masa molecular

Con el tratamiento SDS, las proteínas migrarán en función de su masa molecular. La masa molecular aproximada de las proteínas separadas es, por lo tanto, una función de su distancia de migración. Si se analiza una serie de proteínas con masas moleculares diferentes y conocidas en un gel idéntico, en condiciones idénticas, entonces se puede establecer una curva estándar que puede ser utilizada para determinar la masa molecular de una proteína desconocida. “Un “" estándar de peso molecular "” típico incluye la siguiente mezcla de proteínas:”

Proteína	Masa molecular (kDa)
Fosforilasa B	94
Albúmina de suero bovino	67
Ovoalbúmina	43
Anhidrasa carbónica	30
Inhibidor de tripsina de soja	20.1
a -Lactalbúmina	14.4

La masa molecular se cuantifica de la siguiente manera:

• Mida (en cm) la distancia de migración del frente de tinte
• Mida (en cm) la distancia de migración de la proteína (siempre será menor que el frente del tinte)
• Divida la distancia de migración de proteínas por el frente de colorante distante para obtener el valor de movilidad relativa (siempre < 1)
• Trazar el valor de movilidad relativa (a lo largo del eje x) versus el log de la masa molecular (a lo largo del eje y)
• La relación entre la movilidad relativa y el log de la masa molecular debe ser una función lineal, proporcionando así una curva estándar contra la cual se pueda determinar la masa molecular de una proteína desconocida a partir de su movilidad relativa

Aquí hay un ejemplo de un patrón de masa molecular, y dos muestras desconocidas, analizadas en una SDS PAGE al 10% teñida con Coomassie:

Figura 5.5.4: Ejemplo de electroforesis en gel

El cálculo de las distancias de migración, la movilidad relativa y la relación con Log de la masa molecular arroja lo siguiente:

Figura 5.5.5: Movilidad relativa y masa molecular

• Desconocido #1 tiene un valor de 1.43 para el log de la masa molecular, o una masa de ~26.9 kDa
• Desconocido #2 tiene un valor de 1.33 para el log de la masa molecular, o una masa de ~21.4 kDa
• Una comprobación visual de las incógnitas versus los estándares en el gel anterior indica que los cálculos parecen ser correctos

Hay otras variaciones de SDS PAGE incluyendo:

• Geles discontinuos (es decir, un compuesto de un gel sobre otro) para lograr el “enfoque” de las bandas de proteínas (es decir, bandas más nítidas, produciendo mayor sensibilidad y resolución)
• Geles de gradiente (en lugar de verter un solo gel de% de poliacrilamida, verter un gradiente con una alta concentración en la parte inferior, y una concentración menor hacia la parte superior. Esto permite la resolución de una gama más amplia de muestras de masa molecular)
• Tinción con plata (un tipo de tinción más sensible en comparación con Coomassie - permitiendo la detección de concentraciones más bajas de proteínas)
• Transferencia de bandas proteicas resueltas a un soporte secundario (por ejemplo, nitrocelulosa) para sondear con otros reactivos (es decir, anticuerpos)
• PAGE (sin SDS) de proteínas nativas (para permitir la detección de complejos no covalentes de dos o más proteínas, ya que el SDS alterará dichos complejos)
• SDS PAGE con la adición de agentes reductores (e.g. b-mercaptoetanol, ditiotreitol, etc.). Estos reactivos reducirán los enlaces disulfuro y separarán las cadenas polipeptídicas que están conectadas por dichos enlaces

No obstante, la información anterior abarca lo básico.