5.6: Introducción a la purificación de proteínas

Un procedimiento exitoso de purificación de proteínas puede ser nada menos que increíble. Ya sea que esté comenzando con una proteína recombinante que se produce en E. coli, o tratando de aislar una proteína de algún tejido animal o vegetal, normalmente está comenzando con una mezcla compleja de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, etc. de la que puede tener que extraer miligramo (¡o microgramo!) cantidades de la proteína deseada, a menudo con alta pureza, y ojalá con alto rendimiento.

La purificación de proteínas puede considerarse como una serie de etapas de fraccionamiento diseñadas de manera que:

• La proteína de interés se encuentra casi exclusivamente en una fracción (y con buen rendimiento)
• Una cantidad significativa de los contaminantes se puede encontrar en una fracción diferente

Figura 5.6.1: Fraccionamiento

El primer paso en cualquier purificación es el desarrollo de un ensayo para la proteína de interés

El ensayo puede basarse en alguna característica única de la proteína de interés, posiblemente involucrando:

• Actividad enzimática
• Actividad inmunológica
• Características físicas (por ejemplo, masa molecular, propiedades espectroscópicas, etc.)
• Actividad biológica
• Idealmente, un ensayo debe ser
  • específico (no quieres un falso positivo o falso negativo)
  • rápido (no quieres esperar una semana por los resultados)
  • sensible (no quieres consumir toda tu muestra para analizarla)
  • cuantitativo (necesita una manera precisa de medir la cantidad de su proteína en cada paso de la purificación)

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Durante la purificación, deberá realizar un seguimiento de varios parámetros, entre ellos:

1. El volumen total de su muestra
2. La cantidad total de proteína en tu muestra

· puede estimarse usando E ^1% _280nm =14.5

· En otras palabras, mida la absorbancia a 280 nm, divídala por 1.4 y tendrás la concentración aproximada de proteína en mg/ml

3. La cantidad total de la proteína de interés (la que estás tratando de purificar). Esta información se determinará a partir de su ensayo cuantitativo

Esta información básica le permitirá realizar un seguimiento de los siguientes parámetros durante cada paso de purificación:

1. % de rendimiento para cada etapa de purificación
2. Actividad específica de la proteína deseada (“unidades de actividad” de proteína deseada/mg de proteína total)
3. Mejora de la purificación de cada etapa (por ejemplo, purificación 3.5x)

En el diseño de un esquema de purificación normalmente hay que equilibrar la purificación con el rendimiento.

• Por ejemplo, puede ser relativamente sencillo obtener 90% de material puro con buen rendimiento.
• Sin embargo, puede ser difícil mejorar esa pureza por un percentil adicional y mantener un buen rendimiento.
• La aplicación planificada de la proteína purificada determina la pureza objetivo.
• Si la proteína va a ser utilizada para determinar la información de la secuencia de aminoácidos, tal vez 90% es aceptable. Sin embargo, si el material va a ser utilizado en ensayos clínicos, 99.999+% puede ser la pureza objetivo.

Pasos iniciales en la purificación

• Típicamente (pero no siempre) la proteína de interés está contenida dentro del citoplasma de una célula (a veces, sin embargo, podría ser secretada por la célula al ambiente extracelular). Por lo tanto, las células deben romperse para liberar el citoplasma, un proceso conocido como lisis celular.
• Es sumamente útil tener alguna información no sólo sobre las características físicas y químicas generales de la proteína que intentas purificar, sino también sobre los componentes contaminantes.
• Por ejemplo, muchas proteínas de E. coli son generalmente de bajo peso molecular (<50,000 Da) y algo ácidas en el punto isoeléctrico

Un esquema general típico de un procedimiento de purificación de proteínas podría verse así:

Figura 5.6.2: Etapas de purificación de proteínas

Por lo general, los pasos iniciales en la purificación hacen uso de diferencias físicas y/o químicas generales entre las proteínas solubles y otros componentes celulares.

• Por ejemplo, las proteínas solubles pueden separarse de los desechos celulares generales, y las células intactas, por centrifugación.
• Así, las células se alteran físicamente (a través de homogeneización o una prensa celular) para permitir la liberación del contenido celular. A esto le sigue la centrifugación para separar los componentes generalmente solubles de aquellos que son insolubles.
• Es en este punto que se inicia la recolección de datos con el fin de monitorear la purificación.

Los ácidos nucleicos a veces se pueden eliminar fácilmente de la muestra mediante la adición de compuestos catiónicos grandes tales como polietilenimina o sulfato de estreptomicina.

• Los ácidos nucleicos se unen a estos compuestos a través de interacciones electrostáticas y el complejo precipita y se puede eliminar mediante centrifugación.
• El mismo resultado general se puede obtener mezclando en resinas de intercambio iónico que son intercambiadores de aniones (es decir, las resinas contienen grupos catiónicos) y luego filtrando o centrifugando para eliminar. Al igual que con cualquiera de los dos métodos, se debe confirmar que la proteína deseada no está unida también.

Los fraccionamientos crudos de proteínas se pueden lograr mediante la adición de diversas cantidades de precipitantes como sulfato de amonio, o polietilenglicol (PEG).

• Para este tipo de etapa de purificación se realiza un experimento inicial para monitorear la fracción de proteína global, así como la proteína deseada, permaneciendo en solución (y pellet) en función de la concentración de precipitante.

Sulfato de amonio (% saturado)	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90
Muestra A 280 (en solución)	1000	900	600	200	100	75	50	40	25	20
Ensayo de actividad (unidades) (en solución)	200	200	200	190	170	100	30	5	0	0

Figura 5.6.3: Concentración de proteína y concentración de precipitante

¿Cómo podemos usar esta información para utilizar la precipitación con sulfato de amonio como una etapa de purificación útil en nuestro procedimiento de purificación general?

Comencemos calculando la actividad específica (una medida de pureza) de la muestra inicial:

Actividad específica = unidades totales de proteína deseada/mg de proteína total

Para calcular estos parámetros necesitamos conocer el volumen total de la muestra (además de la información en la tabla anterior). En este caso, el volumen total de la muestra es de 1 L. Conociendo esto, y la absorbancia, podemos determinar la proteína total en la muestra:

Muestra A ₂₈₀ /1.4” mg/ml de muestra

1000/1.4 = 714 mg/ml

714 mg/ml * 1.0L (1000ml/L) = 714,000 mg de proteína total

La proteína de interés se ensayó a 200 unidades presentes en la muestra inicial. Por lo tanto, la actividad específica de la muestra inicial es:

Actividad específica = 200 unidades/714,000 mg = 2.80 x 10 ^-4 unidades/mg

Nota

Nota: las “unidades” de actividad dependen de la proteína de interés. Podría ser una medida de la actividad enzimática, es decir, 1.0 unidad de actividad enzimática da como resultado que se consuma 1 mmol de sustrato en 1 min de tiempo.

Ahora podemos ampliar la tabla anterior para incluir la actividad específica de la muestra

Sulfato de amonio (% saturado)	0	10	20	30	40	50	60	70	80	90
Muestra A 280 (en solución)	1000	900	600	200	100	75	50	40	25	20
Total mg de proteína (en solución)	714,000	643,000	429,000	143,000	71,400	53,600	35,700	28,600	17,900	14,300
Ensayo de actividad (unidades) (en solución)	200	200	200	190	170	100	30	5	0	0
Actividad específica (unidades/mg)	2.80x10 ^-4	3.11x10 ^-4	4.66x10 ^-4	13.3x10 ^-4	23.9x10 ^-4	18.7x10 ^-4	8.40x10 ^-4	1.75x10 ^-4	0	0

Podemos graficar la actividad específica de la muestra restante en solución para las diferentes concentraciones de sulfato amónico agregado:

Figura 5.6.4: Actividad específica y concentración de precipitante

• La actividad específica más alta se observa en solución cuando se agrega sulfato de amonio al 40% de saturación
• ¿Cuál es el aumento de pureza para la muestra de solución al 40%?

Purificación = actividad específica final/actividad específica inicial

Purificación = (23.9x10 ^-4 unidades/mg)/(2.80x10 ^-4 unidades/mg) = purificación 8.5 veces

Sin embargo, la purificación no es toda la historia. También debemos considerar el rendimiento:

Rendimiento (%) = (unidades totales finales/unidades totales iniciales) x 100

Y podemos agregar esta información a nuestras estadísticas de purificación:

Sulfato de amonio (% saturado)	0	10		20	30	40	50	60	70	80	90
Muestra A 280 (en solución)	1000	900		600	200	100	75	50	40	25	20
Total mg de proteína (en solución)	714,000	643,000		429,000	143,000	71,400	53,600	35,700	28,600	17,900	14,300
Ensayo de actividad (unidades) (en solución)	200	200		200	190	170	100	30	5	0	0
Actividad específica (unidades/mg)	2.80x10 ^-4	3.11x10 ^-4		4.66x10 ^-4	13.3x10 ^-4	23.9x10 ^-4	18.7x10 ^-4	8.40x10 ^-4	1.75x10 ^-4	0	0
Purificación	N/A	1.1	1.7		4.8	8.5	6.7	3.0	0.6	-	-
Rendimiento (%)	100	100	100		95	85	50	15	2.5	0	0

Figura 5.6.5: Porcentaje de rendimiento y concentración de precipitante

La información sobre el rendimiento muestra que nuestra proteína de interés comienza a precipitar alrededor de 30% de sulfato amónico. Así, si bien la adición de sulfato amónico al 40% proporciona la mayor purificación, se asocia con una pérdida de 15% de nuestra proteína de interés. Otra opción es agregar sulfato de amonio al 30%. En este caso, realizaríamos una purificación de 4.8 veces, y sufriríamos pérdidas de sólo 5%.

En cada etapa de un esquema de purificación, normalmente nos enfrentamos a una decisión con respecto a una compensación entre pureza y rendimiento

• Si el material de partida es barato, abundante o fácil de obtener, podemos elegir nuestros pasos de fraccionamiento para maximizar la pureza a expensas del rendimiento
• Si el material de partida es caro, limitado o difícil de conseguir, podemos optar por maximizar el rendimiento a expensas de la pureza
• Nuevamente, estas decisiones también están determinadas por el propósito previsto del material final, y por lo tanto, la pureza final deseada.

Así, en el experimento anterior, elegiríamos agregar sulfato de amonio a una concentración entre 20-30% si quisiéramos maximizar el rendimiento, o quizás 40% (o ligeramente superior) si quisiéramos maximizar la purificación.

Cuestiones prácticas con pasos de fraccionamiento con sulfato de amonio

Probablemente nos gustaría eliminar el sulfato de amonio de nuestra muestra (quizás el siguiente procedimiento de purificación no pueda tolerar tampones de alta fuerza iónica). Observe que a partir de los datos de la tabla anterior parece que toda nuestra proteína de interés se precipita si se agrega sulfato de amonio a una concentración de 80%. Así, esto podemos usar esta propiedad de precipitación para eliminar nuestra proteína de la mayor parte del sulfato de amonio:

1. Agregar sulfato de amonio a nuestra muestra a una concentración de 20-40% de saturación (el porcentaje exacto se determina por si deseamos maximizar la pureza o el rendimiento)
2. Centrifugar y desechar el pellet
3. Añadir sulfato amónico a 80% de saturación a la solución retenida
4. Centrifugar y mantener el pellet. Resuspender el sedimento en tampón para solubilizar la proteína.