13.2: Codificación de barras (Actividad)
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- Colocar la muestra en un tubo limpio de 1.5 mL.
- Agregar 100 μl de solución de lisis nuclear al tubo.
- Gire una mano de mano de plástico limpia contra la superficie interna.
- Agregue 500 μl más de solución de lisis nuclear al tubo.
- Incubar el tubo en baño de agua o bloque térmico a 65°C durante 5-15 minutos.
- [Opcional] Agregar 200 μl de solución de precipitación de proteínas a cada tubo incubar en hielo durante 5 minutos.
- Centrifugar durante 4 minutos a velocidad máxima para sedimentar proteínas y restos celulares.
- Transferir 600 μl de sobrenadante a un tubo limpio etiquetado.
- Añadir 600 μl de isopropanol.
- Centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima para sedimentar el ADN.
- Vierta el sobrenadante y agregue 600 μl de etanol al 70% para lavar el sedimento.
- Centrifugue el tubo durante 2 minutos a velocidad máxima y retire con cuidado la solución.
- Secar el pellet al aire durante 10 minutos y agregar 100 μl de la solución de rehidratación de ADN (TE).
- Incubar el ADN a 65°C durante 5-10 minutos para disolverlo.
- Obtener un tubo de PCR que contiene perlas de PCR listas para usar. Etiquete el tubo con su número de identificación.
- Use una micropipeta con una punta fresca para agregar 23 μL de una de las siguientes mezclas de imprimación/colorante de carga a cada tubo. Permita que las perlas se disuelvan por 1 minuto.
- Plantas: cebadores RbcL (RbClaf/RbCLA rev)
- Peces: cebadores COI (VF2_T1/ FishF2_T1/ FishR2_T1/ Fr1d_T1)
- Insectos: (Lepf1_t1/ LePr1_T1)
- Agrega 2 μl de tu ADN directamente en la mezcla apropiada de imprimación/colorante de carga.
- Colocar los tubos en un termociclador.
- Vierta 2% de agarosa en el aparato de fundición en el refrigerador.
- Se necesitaban hacer 2 geles por clase → 100ml de TBE con agarosa 2g
- Agregue 5 μl de solución segura SYBR a la agarosa fundida antes de colar.
- Coloca 2 juegos de peines en el gel → en un extremo y en el medio.
- Cargar muestras de escalera de ADN y PCR.
- Ejecutar el gel a 120V durante 30 minutos.
- Visualice en el transiluminador UV.
- Documente con una cámara.
- Enviar amplicones de muestras verificadas para secuenciación.
- Gen RbcL vegetal
- RbCLAF 5'- ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3' (cebador directo)
- RbClar 5'- GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3' (cebador inverso)
- Gen coi animal
- LePF1 5'- ATTCAACCAATCAATAAAAGATATTGG -3' (cebador directo)
- LePr1 5'- TAAACTTCGGATGTCCAAAAAATCA-3' (cebador inverso)
- vf1f 5'- TCTCAACCAACCACAAAGACATTGG-3' (cebador directo)
- vf1r 5'- TAGACTTCGGGTGGCCAAAGAATCA-3' (cebador inverso)