1.5: Microscopía

Objetivos de aprendizaje

Metas:

• Utilizar y cuidar adecuadamente un instrumento científico sensible.
• Aprende las técnicas necesarias para preparar las células para su visualización con un microscopio.
• Obtener una idea del tamaño de las células.

Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

• Identificar las partes de un microscopio y sus funciones.
• Lleve, use y almacene correctamente un microscopio.
• Prepare un portaobjetos de montaje húmedo.
• Ver y enfocar especímenes bajo un microscopio.
• Determinar el aumento total de un espécimen.
• Localice una muestra si se le da un portaobjetos.

Introducción

En Biología, el microscopio óptico compuesto es una herramienta útil para estudiar especímenes pequeños que no son visibles a simple vista. El microscopio utiliza luz brillante para iluminar a través del espécimen y proporciona una imagen invertida a alta ampliación y resolución. Hay dos lentes que magnifican la imagen del espécimen: la lente objetivo en la pieza nasal y la lente ocular (u ocular). Para determinar el aumento total del espécimen, se debe multiplicar la ampliación de lente objetivo con la ampliación de lente ocular.

Los científicos y técnicos suelen utilizar microscopios de luz para estudiar las células. Las células procariotas son muy simples y carecen de un núcleo o orgánulos unidos a membrana y son de tamaño pequeño. Por otro lado, las células eucariotas son más complicadas ya que contienen un núcleo y muchos orgánulos especializados. La estructura de una célula dicta su función; así, cada célula eucariota se ve muy diferente de la siguiente. Es por ello que una célula cardíaca se ve completamente diferente de una neurona (célula cerebral).

Es muy importante aprender a manejar y usar un microscopio correctamente. Revise las siguientes reglas y consejos para usar y manejar su microscopio.

Figura 1. Partes etiquetadas de un microscopio.

Reglas Generales

• Siempre INICIAR y TERMINAR con la lente de baja potencia al ponerse O quitar una diapositiva.
• Nunca gire la pieza de la nariz por la lente del objetivo.
• No se moje ninguna porción del microscopio, especialmente las lentes de escenario y objetivo.
• Use solo papel para lentes para limpiar lentes de microscopio.

Limpieza del Microscopio

Si es necesario, obtenga un pequeño cuadrado de papel para lentes (y SOLO papel para lentes) y limpie suavemente las lentes del microscopio directamente, en este orden:

1. la superficie inferior de todas las lentes de objetivo
2. la lente ocular
3. la lente del condensador y la carcasa de la luz

Parte I: Encontrar la carta

Materiales

• Microscopio
• Papel para lentes
• Diapositiva de letra “E”
• Escenario Micrometer Slide

Procedimiento

1. Siempre use una mano alrededor del brazo del microscopio y una mano debajo de la base del microscopio.
2. Llévala en posición vertical sin balancear, volcar, dejar caer o golpear el microscopio.
3. Coloque el microscopio suavemente en la mesa de laboratorio con el brazo hacia usted. Nunca coloque el microscopio cerca del borde, y nunca lo deslice sobre la mesa.

Identifique las siguientes partes del microscopio con un socio. Marque cada parte a medida que avanza. Si no está seguro de algún componente, consulte a su instructor.

• Ocular (lente ocular)
• Anillo de Nosepiece (torreta)
• Lentes de objetivo (baja, media, alta potencia)
• Escenario
• Controles de Escenario
• Lente condensadora de diafragma iris
• Fuente de luz
• Perilla de intensidad de luz (reóstato)
• Perilla de ajuste de enfoque grueso
• Perilla de ajuste de enfoque fino

4. Enchufe y coloque cuidadosamente el cable eléctrico para evitar que se tropiece o que el microscopio se retire de la mesa.
5. Encienda el microscopio y gire el anillo de la pieza nasal (torreta) para ajustar la lente del objetivo 10x en su lugar. ¡No utilices la lente objetivo para rotar!
6. Gire el control de luz (reóstato) hasta la mitad para ajustar la cantidad de luz.
7. El aumento total que observas al mirar a través de un microscopio es el aumento de la lente ocular multiplicado por el aumento de la lente objetivo. Rellene la Tabla 5.1 para indicar el aumento total logrado por cada lente.

Cuadro 1. Aumento total logrado usando varios objetivos Lentes de un microscopio de luz compuesto

Nombre de la lente	Lente de objetivo	Lente Ocular	Ampliación Total

8. En el costado del microscopio hay dos perillas, una encima de la otra. La más grande de las dos perillas es la perilla de ajuste de enfoque grueso. Gire la perilla para que el escenario baje lo más lejos que pueda.
9. Limpie todas las lentes con papel para lentes. ¡Nunca uses toallas de papel ni toallitas kimwipes o camisa!
10. Obtenga una diapositiva de letra “e” de su instructor. Dibuja la “e” en la Tabla 5.2 según la veas con los ojos (no a través del microscopio).

Cuadro 2. La letra “e” vista a diferentes aumentos usando un microscopio óptico

Letra “e” como se ve...		Dibujo
a simple vista
Aumento total de 100X
Ampliación total 400X
Ampliación total de 1000X
Ampliación total de 1000X
¿En qué dirección se mueve la “e” (mientras miras al microscopio), cuando mueves el escenario hacia la derecha?

11. Coloque el tobogán en el escenario y asegúrelo con el clip del escenario.
12. Use la perilla de enfoque grueso para mover el escenario lo más alto posible.
13. Use perillas de ajuste de escenario para centrar la “e” de manera que la luz de la fuente de luz pueda pasar a través de ella.
14. Mirando a través de las lentes oculares, baje la etapa con la perilla de ajuste de enfoque grueso hasta que la “e” salga a la vista.
15. Usa la perilla de ajuste de enfoque fino para que la imagen sea lo más clara posible.
16. En este punto hay diferentes ajustes que puedes hacer para mejorar la calidad de la imagen:
17. El reóstato en el costado del microscopio controla la intensidad de la luz. Si es demasiado brillante o tenue en cualquier momento, usa esta perilla para ajustar la luz.
18. El condensador también ajustará la intensidad de la luz. El condensador recoge y enfoca la luz para iluminar el espécimen. Únicamente usa esto si el reóstato no logró mejorar tu imagen. Mueva el condensador con la perilla de ajuste del condensador para que toque el escenario. Bájala lentamente para mejorar la iluminación de tu muestra. Por lo general, debe estar aproximadamente ½ pulgada por debajo del escenario.
19. El diafragma iris ajusta la abertura de la abertura y controla la cantidad de luz que sale del condensador (o ilumina la muestra). Se puede abrir y cerrar esta abertura, para la mayoría de los propósitos debe estar completamente abierta, pero a veces cerrarla parcialmente aumentará el contraste en la imagen.
20. Dibuje la letra “e” tal como aparece a través del microscopio en la Tabla 4-2. Tenga en cuenta el cambio de orientación. Observe que el ocular IZQUIERDO puede ser girado, pero la escala ocular (conocida como retícula) permanece en el medio del cristalino ocular. Tenga en cuenta que el ocular DERECHO se puede girar, para mover la posición del puntero.
21. Mueve el escenario lentamente hacia la derecha. Anote en qué dirección se mueve la “e” a medida que mira a través del microscopio y registra en la Tabla 4-2.
22. Mueva la diapositiva hacia la izquierda para volver a centrar la “e”.
23. Una vez que la “e” se vuelve a centrar y enfocar, gire la pieza nasal a la lente del objetivo 40x y colóquela en su lugar. Usa el enfoque fino para que la imagen sea clara. Solo si es necesario, realice ajustes de luz con el reóstato, condensador o diafragma. Dibuja todo lo que veas a través del microscopio en la Tabla 4-2.
24. Una vez que la “e” se vuelve a centrar y enfocar, gire la pieza nasal a la lente del objetivo 40x y encaje en su lugar. Usa el enfoque fino para que la imagen sea clara (NUNCA uses el enfoque grueso con este aumento o cualquier aumento mayor o corres el riesgo de chasquear la diapositiva o peor, ¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡ Solo si es necesario, realice ajustes de luz con el reóstato, condensador o diafragma. Dibuja todo lo que veas en el microscopio en la Tabla 4-2. Responde las preguntas a continuación.
25. Para usar la lente de inmersión en aceite, gire la pieza nasal ENTRE las lentes 40x y 100x para que la varita que contiene el aceite pueda llegar a la diapositiva. Coloca una generosa gota de aceite en la diapositiva y coloca la lente del objetivo 100x en su lugar. La lente se deslizará en la gota de aceite.
26. Usa el enfoque fino para que la imagen sea clara. Solo si es necesario, realice ajustes de luz con el reóstato, condensador o diafragma. Dibuja lo que veas en la Tabla 4-2.
27. NUNCA regrese a la lente del objetivo 40X después de que haya aceite en la diapositiva. Si tiene problemas para enfocar usando la lente de inmersión en aceite, debe regresar y usar la lente 10x para volver a centrar (gire la pieza nasal para que la lente del objetivo 40x NO se arrastre a través del aceite en la diapositiva). Después vuelve directamente a la lente 100x. Si esto no funciona, la diapositiva debe limpiarse y debe comenzar de nuevo.

Cuando termine con la diapositiva, baje la platina y retire la diapositiva. (No baje el escenario si va a ver una diapositiva diferente). Limpia el aceite del portaobjetos y devuélvelo a tu instructor.

Parte II: Diámetro del Campo

Los microscopios son para la ampliación de imágenes demasiado pequeñas para ser vistas a simple vista. Sin embargo, pueden ser utilizados como una herramienta para estimar el tamaño del objeto que se está viendo. Para ello, debes conocer el diámetro de cada campo de visión con cada lente objetivo. Luego puede estimar la cantidad del campo que toma su objeto en el campo y compararlo con el diámetro medido. Por ejemplo, digamos que el diámetro de campo usando la lente del objetivo 40x es de 0.10 mm. Luego ve un objeto usando esa lente que ocupa ¼ del campo de visión. Luego puede estimar que el objeto tiene ¼ (0.10mm) de largo o 0.025mm. Para determinar el diámetro del campo, utilizará un portaobjetos de micrómetro de etapa, que es básicamente una regla muy fina (generalmente de 2 mm) que está grabada en un portaobjetos de microscopio.

Figura 2. Micrómetro de etapa

Procedimiento

1. Obtener un portaobjetos micrométricos de etapa. TEN MUCHO CUIDADO. Un portaobjetos de micrómetro de etapa es costoso, ¡así que por favor trátelo con respeto! Coloque el portaobjetos del micrómetro del escenario en el escenario y concéntrese en las marcas milimétricas usando la lente del objetivo 10x. Registre el diámetro del campo en mm cuando utilice esta lente en la Tabla 3.
2. Cambie a la lente de objetivo 40x y enfoque. Determinar el diámetro del campo en mm con el micrómetro y registrar en la tabla 3. Repita los mismos pasos para las otras lentes de objetivo.
3. Convertir los diámetros a micrómetros (μM). Todas las mediciones de células y orgánulos se realizarán en μM. Limpie el portaobjetos cuidadosamente y colóquelo de nuevo en su bandeja sobre la mesa de demostración.

Cuadro 3. Determinar el campo de visión usando un micrómetro de etapa

Lente Usada	Ampliación Total	Diámetro de Campo (mm)	Diámetro de Campo en (µm)

Parte III: Hacer monturas mojadas

Materiales

Toboganes (en tarro de alcohol) Cubierta deslizante (en frasco de alcohol) Toallas de papel Bandeja o vaso de precipitados para lavar portaobjetos Fórceps Pipetas de transferencia Cuchillo y tabla de cortarPalillos de dientes

Cebolla Yodo (frasco cuentagotas) Azul de metileno (frasco cuentagotas) Hoja de Elodea (en vaso de precipitados de agua) Agua de estanque (en vaso de precipitados) 20% de agua salada (botella cuentagotas) Agua desionizada (botella cuentagotas)

Diapositivas Preparadas: Paramecio Spirogyra Frotis de sangre humana Sangre de células falciformes humanas Frotis de sangre de anfibios

Procedimiento

Células de la mejilla humana

Figura 3. Célula de mejilla humana con zoom de 400x.

La mejilla humana está revestida de células epiteliales. Serán utilizados hoy para que observes células animales eucariotas y su núcleo. Rasparás y teñirás una muestra de las células de tu mejilla con el colorante azul de metileno. El tinte te permitirá teñir claramente los núcleos de las células. Ten cuidado con los tintes utilizados para las monturas mojadas ya que te mancharán la piel y la ropa. Además, los portaobjetos y cubreobjetos que usarás se almacenan en alcohol. Asegúrese de secar los portaobjetos y cubreobjetos con toallas de papel (no el costoso papel para lentes) antes de preparar sus diapositivas de montaje húmedo.

1. Obtenga un portaobjetos de microscopio seco y un cubreobjetos.
2. Pon una gota de azul de metileno en el portaobjetos.
3. Raspe suavemente el interior de su mejilla con un palillo de dientes y arremolínelo en el tinte en el portaobjetos.
4. Coloque un cubreobjetos en la suspensión y vea con un aumento total de 1000X
5. Dibuja 1-3 celdas lo suficientemente grandes como para mostrar los detalles que ves en tu manual de laboratorio. Marcar su membrana celular, citoplasma y núcleo. Asegúrese de indicar el aumento utilizado y el nombre del espécimen. Indique también el tamaño de celda estimado en micrómetros debajo de su dibujo. Ver el ejemplo (al que le faltan las etiquetas).

Elodea Leaf Wet Mount

La membrana celular no es visible en la hoja de Elodea debido a su proximidad a la pared celular mucho más gruesa. Para poder ver la membrana, agregarás sal a la Elodea. El agua fluirá fuera de las células de Elodea por ósmosis, encogiendo la membrana celular lejos de la pared celular rígida (plasmólisis).

1. Consigue un portaobjetos de microscopio. Colocar 2 gotas de agua DI a la izquierda y 2 gotas 20% de sal a la derecha.
2. Obtener una hoja de un tallo de Elodea y cortar la hoja por la mitad. Coloca media hoja en cada solución.
3. Espere 3-5 minutos y luego coloque un cubreobjetos sobre cada hoja (elimine el exceso de agua).
4. Ver con un aumento total entre 400X.
5. Busque células que hayan sido sometidas a plasmólisis. Si no se encuentra ninguno, vuelva a preparar la diapositiva.
6. Dibuja 2-3 celdas conectadas lo suficientemente grandes como para mostrar el detalle que ves. Marque la pared celular, la membrana celular, el citoplasma y los cloroplastos en su manual de laboratorio. Asegúrese de indicar el aumento utilizado y el nombre del espécimen. Indique también el tamaño de celda estimado en micrómetros debajo de su dibujo.

Figura 4. Células Elodea a 400x

Figura 5. Células de Elodea
sometidas a plasmólisis a 400x

Membrana de Cebolla

Los bulbos de cebolla son en realidad hojas hinchadas que forman una estructura subterránea. Aunque no son una buena fuente para ver cloroplastos, son una excelente fuente para ver núcleos de plantas eucariotas.

Figura 6. Células de cebolla a 400x

1. Obtenga un portaobjetos de microscopio seco y un cubreobjetos.
2. Corta un pequeño cuadrado de una capa de la cebolla. Use fórceps para pelar la membrana delgada, blanca y transparente del lado cóncavo interior de una sección de cebolla (solo necesita una pieza pequeña, aproximadamente del tamaño de una goma de borrar de lápiz) y colóquelas en la diapositiva. Trate de suavizar la membrana transparente de cebolla lo más plana posible.
3. Agrega una gota de yodo a la membrana y espera 30 segundos. Cubrir la membrana con un cubreobjetos. Coloca la diapositiva dentro de la toalla de papel doblada y acaricia suavemente durante 1 segundo para eliminar el exceso de tinte.
4. Visualiza con un aumento total de 100X o 400X, para que puedas ver 2-3 celdas.
5. Dibuja 2-3 celdas conectadas lo suficientemente grandes como para mostrar el detalle que ves. Marcar la pared celular, el núcleo y el citoplasma. Asegúrese de indicar el aumento utilizado y el nombre del espécimen. Indique también el tamaño de celda estimado en micrómetros debajo de su dibujo.

Estanque Agua Húmedo

Prepararás una montura húmeda de uno de los siguientes protistas que se pueden encontrar en el agua del estanque: Euglena, Spirogyra, Paramecium, y/o Amoeba.

1. Consigue un tobogán de depresión y sécalo. El tobogán de depresión tiene una sangría curva en el medio del tobogán, lo que permite que las criaturas vivientes se muevan y no se aplasten.
2. Poner una gota de metilcelulosa y una gota del agua del estanque o cultivos.
3. Cuidadosamente ponte un cubreobjetos. Si tienes demasiado líquido en el portaobjetos, entonces usa suavemente una esquina de una toalla de papel para absorber el exceso de líquido.
4. Ver con un aumento total de 100X o 400X.

6. Dibuja los organismos que veas. Asegúrese de indicar el aumento utilizado y el nombre del espécimen. Indique también el tamaño de celda estimado en micrómetros debajo de su dibujo.

Diapositivas Preparadas

Observará varias diapositivas preparadas, entre ellas Paramecium, Spirogyra, Frotis de sangre humana, frotis de sangre roja de células falciformes humanas, frotis de sangre de rana y posiblemente otros. Visualiza bajo el microscopio usando el aumento más alto para obtener los mejores detalles celulares y dibuja lo que ves. Asegúrese de indicar el aumento utilizado y el nombre del espécimen. Además, indica el tamaño estimado de celda en micrómetros debajo de tu dibujo.

Figura 7. Especímenes a 400x de Magnificación.De izquierda a derecha: Spirogyra, Paramecium, Frotis de Sangre Humana, Células Falciformes Humanas.

Parte IV: Check-out de laboratorio

Marque cada tarea cuando se complete. El instructor deberá firmar antes de guardar su microscopio.

Microscopio compuesto de retorno

• Gire la lente objetivo de baja potencia en su posición
• Usa enfoque grueso para elevar la pieza de la nariz hacia la parte superior
• Quitar la diapositiva del escenario
• Asegúrese de que la barra de los clips de escenario no se pegue
• Gire el reóstato al nivel más bajo antes de apagar la luz
• Desenchufe y envuelva el cable de alimentación de acuerdo con las instrucciones del instructor
• Lleve el microscopio correctamente al gabinete y regrese a la repisa correcta

Limpieza de monturas húmedas

• Enjuague el portaobjetos en un vaso de precipitados con agua, retire y devuelva la cubierta y deslice en los frascos correctos
• Vuelva a colocar los portaobjetos preparados en la bandeja correcta en la mesa de demostración
• Apriete todas las tapas de botellas de reactivo.
• Limpiar la mesa de demostración
• Limpie todas las mesas con esponja húmeda

Firma del Instructor

Preguntas de Estudio

1. En la página siguiente, etiquete las partes del microscopio y enumere su función.
2. ¿Cómo se lleva correctamente un microscopio?
3. ¿Cómo se guarda correctamente el microscopio?
4. ¿Cuál es el poder de aumento de:
   • ¿Lente objetivo de alta potencia?
   • ¿Lente de objetivo de potencia media?
   • ¿Lente objetivo de baja potencia?
   • ¿Lente ocular?
5. ¿Cómo se determina el aumento total de una muestra?
6. Cuando aumenta el aumento, ¿cómo cambia el tamaño del campo de visión?
7. ¿Por qué es importante colocar el medio sobre un portaobjetos antes de seleccionar el espécimen que se va a montar?
8. Nombra una forma para estar seguro de que el espécimen se encontrará en el campo de visión cuando cambie el aumento.
9. ¿Cuáles son las características distintivas de una célula vegetal versus una célula animal?
10. Conociendo el tamaño del campo de visión utilizando una de las tres lentes de aumento, se podrá determinar el tamaño de un espécimen que se esté observando.

Figura 8. Microscopio en blanco para etiquetar piezas.