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LibreTexts Español

1.17: ELISA

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    55070

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    Objetivos de aprendizaje

    Metas:

    • Demostrar el poder de un ELISA como herramienta de diagnóstico biomédico.
    • Realizar un ELISA.
    • Analizar los resultados del ELISA y presentar un diagnóstico basado en los resultados.

    Resultados de aprendizaje de los estudiantes:

    Al finalizar este laboratorio, los estudiantes serán capaces de:

    • Describir cómo funciona un ELISA.
    • Dado un conjunto de datos, interpretar los resultados del ELISA.

    Introducción

    ELISA (Enzyme-Linked ImmunoAssay) es una técnica inmunológica utilizada para detectar la presencia y concentración de un antígeno o anticuerpo en una muestra. El poder de un ELISA se basa en la especificidad extrema de la interacción antígeno-anticuerpo. Los ELISA tienen una amplia gama de aplicaciones, especialmente como herramientas de diagnóstico médico.

    Dibujo de las reacciones en un ensayo ELISA: el antígeno está unido por un anticuerpo que está unido por otro anticuerpo unido a una enzima. La enzima convierte un sustrato en un producto
    Figura 1. Reacciones ELISA

    Este laboratorio es una simulación de un ELISA realizado en pacientes para determinar si pueden haber estado expuestos al virus VIH. Los pacientes expuestos al virus (antígeno extraño) desarrollarán anticuerpos contra el virus VIH, y los anticuerpos circularán en el torrente sanguíneo. Al analizar las muestras de sangre del paciente, se puede medir la presencia o ausencia de estos anticuerpos usando el ELISA.

    En el ELISA realizado para este laboratorio, el antígeno (del virus VIH) se adsorbe a la superficie de los pocillos de plástico (en la tira de 8 pocillos o placa de 96 pocillos). Se agregan muestras de suero sanguíneo de pacientes (que pueden contener anticuerpos contra el antígeno). Si hay anticuerpos presentes, entonces se forman complejos antígeno-anticuerpo (Proceso Inmunoabsorbente). La detección de estos complejos se logra mediante la adición de un anticuerpo secundario que detecta todos los anticuerpos humanos. Para facilitar la detección, el anticuerpo secundario se ha unido covalentemente a una enzima. Cuando la enzima se une a su sustrato, se produce una reacción para crear un producto coloreado. En resumen, para los pacientes con VIH, los anticuerpos en su sangre se unen al antígeno del VIH, el anticuerpo secundario se unirá a los anticuerpos humanos, y la enzima producirá un producto coloreado que es fácil de visualizar. Para los pacientes que no tienen anticuerpos contra el antígeno del VIH, no se unen anticuerpos en la primera etapa y al final no se produce ningún producto coloreado.

    Aplicación clínica

    Escenario: Trabajas en una clínica y entran dos pacientes que han tenido posible exposición al VIH. El ELISA es el primer método de cribado de anticuerpos contra el VIH porque utiliza materiales y maquinaria menos costosos que otros procedimientos de diagnóstico (es decir, Western Blot o PCR). Se toma una muestra de sangre y la centrifuga para separar el suero sanguíneo de los glóbulos rojos y ahora se estará realizando un ELISA, analizando el suero para detectar la presencia de anticuerpos contra el VIH.

    Materiales

    foto de los materiales que estarán presentes en su estación de laboratorio. Incluye micropipeta y puntas, una botella de lavado, una rejilla con tubos de microcentrífuga y los pozos como tira.
    Figura 2. Materiales de laboratorio ELISA

    Reactivos

    Muestras en tubos de microfuga

    • (VERDE) — Control Positivo: Suero con Anticuerpos contra el antígeno del VIH
    • (AMARILLO) — Control negativo: Suero sin anticuerpos contra el antígeno del VIH
    • (ROSA) — Suero Sanguíneo del Paciente A (anticuerpo primario potencial)
    • (AZUL) — Suero Sanguíneo del Paciente B (anticuerpo primario potencial)
    • (CLEAR) — Anticuerpo Secundario: Inmunoglobulina Anti-Humana unida a una enzima
    • (AMBAR) — Sustrato:
    • Sustrato cromogénico de tetrametilbencidina (TMB)

    Equipo

    • Tiras ELISA de 8 pocillos recubiertas con proteína VIH (antígeno)
    • Micropipeta P200
    • Caja de puntas de pipeta P200
    • Rack para tubos de microcentrífuga con muestras
    • Botellas de agua con tampón de lavado PBS
    • Cubo de residuos para puntas
    • Sartén para tiras de lavado
    • Toallas de papel

    Procedimiento

    Paso 1: Recubrir Antígeno a Placa (Proteínas de VIH Inactivadas) *Este paso ha sido completado para ti*

    1. Se agregaron 200-μL Proteínas (antígenos) de VIH inactivadas a cada pocillo de la tira ELISA de 8 pocillos
    2. La tira se cubrió con envoltura plástica y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora.

    Paso 2: Bloquear la unión no específica de anticuerpos *Este paso ha sido completado para usted*

    1. El contenido de la tira de 8 pocillos se vació volteando boca abajo y sacudiendo hasta que no hubo más líquido.
    2. Se añadió Solución de Bloqueo a cada pocillo. Este paso evitará la unión no específica de los anticuerpos.

    Paso 3: Agregar la muestra (con posible anticuerpo primario)

    Comience el experimento aquí: Su tira ELISA recubierta de antígeno ya está lista para que agregue las muestras*

    Nota

    IMPORTANTE: Antes de agregar las muestras, mezcle las soluciones invirtiendo los tubos. Recuerda cambiar las puntas de pipeta entre cada solución.

    foto de una mano usando un marcador para marcar un lado de la tira del pozo para mantener su orientación.
    Figura 3. Marcado para orientar la tira del pozo
    1. Marque un lado de la tira con un marcador de laboratorio para mantenerla orientada durante el procedimiento.
    2. Agregar 100-μL de Control Positivo (tubo VERDE) a los pozos 1 y 2.
    3. Agregar 100-μL de Control Negativo (tubo AMARILLO) a los pozos 3 y 4.
    4. Agregar 100-μL de Suero Sanguíneo del Paciente A (tubo PINK) a los pozos 5 y 6.
    5. Agregar 100-μL de Suero Sanguíneo del Paciente B (tubo AZUL) a los pozos 7 y 8.
    6. Dejar reposar por lo menos 5 minutos.
    7. Vacíe el contenido de la tira de 8 pocillos volviéndola boca abajo y sacudiendo hasta que no salga más líquido de la tira. Seque suavemente sobre una toalla de papel para eliminar cualquier líquido restante.
    8. Lavar. Llene los pocillos hasta la parte superior con tampón PBS. Vacíe el contenido como se indica arriba.
    9. Repita este paso de lavado 3 veces más.
    foto de una persona lavando los pozos con una botella de chorros sobre un fregadero.
    Figura 4. Lavado de los pozos

    Paso 4: Añadir el Anticuerpo Secundario

    1. Agregue 100-μL de Anticuerpo Secundario (tubo CLEAR) a todos los pozos. Dejar reposar durante 5 minutos.
    2. Vacíe el contenido de la tira de 8 pocillos volviéndola boca abajo y sacudiendo hasta que no salga más líquido de la tira. Seque en una toalla de papel antes de lavar.
    3. Lavar. Llene los pozos hasta la parte superior con Buffer. Vacíe la tira y sécala sobre toallas de papel.
    4. Repita este paso de lavado 3 veces más.

    Paso 5: Detectar la presencia de reacción antígeno-anticuerpo

    1. Agregue sustrato de 100-μL (tubo AMBER) a todos los pozos. Después de unos minutos, algunos pozos pueden comenzar a cambiar de color. Un cambio de color a azul indica la presencia del complejo antígeno-anticuerpo. Cuantos más anticuerpos se unan al antígeno, más azul será la solución.
    2. Rellene la presencia de color en la tabla a continuación y responda las preguntas en la página de resultados.
    foto de 2 pozos con color azul y dos pozos sin color
    Figura 5. Pozos positivos (diferentes tonos de azul) y pozos negativos (sin color)

    Resultados

    Usando la siguiente tecla de color, registre sus resultados en la siguiente tabla:

    0 = sin color + = azul muy claro ++ = azul claro +++ = azul oscuro

    Datos Cuadro 1. Presencia de complejo antígeno-anticuerpo

    Bueno #

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    Muestra añadida

    Color

    Análisis de datos

    1. ¿Su control positivo exhibió cambios de color? De no ser así, ¿cómo pudo haber ocurrido esto?
    2. ¿Su control negativo se mantuvo claro? De no ser así, ¿cómo pudo haber ocurrido esto?
    3. Comparar el paciente A con el control positivo y negativo. ¿Qué se puede deducir sobre el padecimiento del paciente A?
    4. Comparar el paciente B con el control positivo y negativo. ¿Qué se puede deducir sobre el padecimiento del paciente B?

    Preguntas de Estudio

    1. Describir un ensayo ELISA.
    2. Dibuja el Pozo de Control Positivo después del Paso 2.
    3. Dibuje y etiquete un diagrama del pozo de control positivo al final del procedimiento. ¿De qué color es el producto?
    4. Dibujar el Pozo de Control Negativo al Final del procedimiento.

    Atribución

    Adaptado de Lab 17 ELISA por Sandra Slvka, PhD, Southern California Biotech Center, San Diego Miramar College, CA. Licencia CC-BY-NC-SA 4.0

    This page titled 1.17: ELISA is shared under a CC BY-NC-SA 4.0 license and was authored, remixed, and/or curated by Orange County Biotechnology Education Collaborative (ASCCC Open Educational Resources Initiative) .