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1.2: Extracción de ADN de plásmido (Mini-Prep)

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  • Page ID
    57439
    • Nathan Reyna, Ruth Plymale, & Kristen Johnson
    • Ouachita Babtist University & University of New Hampshire

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    Extracción de ADN de plásmido Zymo-Pure (método de microcentrífuga)

     

    Objetivo de aprendizaje
    • Aislamiento de ADN plasmídico de cultivos durante la noche en LB.

    Este método se basa en columnas de espín y purifica hasta 100\(\mu g\) de ADN plasmídico exento de endotoxinas ultrapuro en menos de 15 minutos. El resultado es ADN plasmídico adecuado para transfección, digestión con endonucleasas de restricción, transformación bacteriana, amplificación por PCR y secuenciación de ADN. (ZymoPure Plasmid Miniprep Kit)

    Nota

    Vea el video de Youtube para preguntas sobre el protocolo Miniprep

    ZymoPure Plasmid Miniprep video

    Nota

    El reactivo P1 es sensible a la temperatura debido a que la RNasa está presente, y debe mantenerse en la nevera o en hielo en todo momento. Todos los demás reactivos se almacenarán a temperatura ambiente.

    Nombre y código del reactivo Temperatura de almacenamiento
    ZymoPure™ P1 (Rojo) 4°C
    ZymoPure™ P2 (Verde) Temp.
    ZymoPure™ P3 (Amarillo) Temp.
    Buffer de unión ZymoPure™ Temp.
    ZymoPure™ Lavado 1 Temp.
    ZymoPure™ Lavado 2 Temp.
    Buffer de elución ZymoPure™ Temp.
    Columnas Zymo-Spin™ II-P (deben tener anillo morado) Temp.
    Tubos de Recolección Temp.

    Procedimiento visual de Zymo Plasmid Mini-Prep

    2021-09-07 10.56.35.png

    CONSEJOS ANTES DE COMENZAR

    El primer par de veces haces la Mini-Prep, en el protocolo ¡INDICAR/etiquetar DONDE está tu ADN para cada uno de los pasos! (por ejemplo, el ADN está en el sobrenadante/líquido O el ADN está en el sedimento). Cada paso a continuación tiene una opción de “círculo uno” preguntando dónde está el ADN! (pellet o sobrenadante).

    Nota

    Si entiendes exactamente dónde está tu ADN en cada uno de los pasos, ¡no perderás tu ADN!!

    Protocolo: (asegúrate de tener todos los reactivos antes de comenzar... ¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡

    1. Usando una pipeta serológica, pipetee 1.0 a 3 mL (preferiblemente 3 ml) de cultivo bacteriano en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Centrifugue este tubo de microcentrífuga a toda velocidad durante 20 segundos. Verás una pequeña forma de bolita en la parte inferior del tubo. (Debes repetir los pasos 1-2 para obtener más de 1 ml de células

      ¿Dónde está tu ADN? Pellet o sobrenadante
    2. Retire la mayor cantidad posible de medio vertiéndolo en la bolsa Biohazard. ¡No interrumpan el pellet celular! (Repita los pasos 1-2 para aumentar la concentración celular: Sin embargo, 1-2ml de cultivo debería ser suficiente plásmido).

    ¿Dónde está tu ADN? Pellet o sobrenadante

    1. Agrega 250\(\mu\) L de ZymoPure ™ P1 (Rojo) al sedimento de células bacterianas y vórtice o pipetea el sedimento para resuspenderlo completamente. (P1 se almacena en la nevera a 4°C. Mantener en hielo cuando no esté en uso.) Esta etapa involucra a RNasa para purificar el ADN destruyendo cualquier ARN en la muestra.

    ¿Dónde está tu ADN? Pellet o sobrenadante

    1. Añadir 250\(\mu\) L de ZymoPure™ P2 (Verde) e inmediatamente mezclar invirtiendo suavemente el tubo 6-8 veces. ¡No vórtices! Dejar reposar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. No deje reposar por más de 3 minutos. (Las células se lisan completamente cuando la solución parece transparente, púrpura y viscosa).

    ¿Dónde está tu ADN? Pellet o sobrenadante

    • Centrifugar el lisado neutralizado por 5 minutos a 16,000 xg (o velocidad máxima). (No interrumpa los restos celulares blancos/peletizados).
    2. Agregue 275\(\mu\) L de tampón de unión ZymoPure ™ al lisado aclarado de la etapa 8 y mezcle bien invirtiendo el tubo tapado 8 veces.
    3. Coloca una Columna Zymo-Spin ™ II-P (Anillo Morado) en un Tubo de Recolección y transfiere toda la mezcla del paso 9 vertiéndola o pipeteándola a la Columna Zymo-Spin TM II-P.
    4. Incubar el conjunto Zymo-Spin ™ II-P/tubo de recolección a temperatura ambiente durante 2 minutos y luego centrifugar a 5,000 xg durante 1 min. Deseche el flujo a través de la bolsa Biohazard.
    6. Agrega 800\(\mu\) L de ZymoPure ™ Wash 2 a la Columna Zymo-Spin ™ II-P y centrifuga a 5,000 xg durante 1 min. Deseche el flujo a través.
    7. Agrega 200\(\mu\) L de ZymoPure ™ Wash 2 a la Columna Zymo-Spin ™ II-P y centrifuga a 5,000 xg durante 1 min. Deseche el flujo a través.
    8. Centrifugue la Columna Zymo-Spin™ II-P a\(\ge\) 10,000 xg (velocidad completa) durante 1 min para eliminar cualquier tampón de lavado residual.
    9. Transfiera la Columna Zymo-Spin™ II-P a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml y agregue 25\(\mu\) L de tampón de elución ZymoPure ™ (calentado 50\(^{\circ}C\) - opcional) directamente a la matriz de la columna. Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos, y luego centrifugar a\(\ge\) 10,000 xg (velocidad completa) por 1 minuto en una microcentrífuga. (el tampón calentado y una incubación de 5 min puede aumentar las concentraciones de plásmido)

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