1.3: Doble digestión de ADN
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Dos enzimas de restricción se utilizan simultáneamente para digerir el ADN en una sola reacción.
| Nombre del reactivo | Temperatura de almacenamiento |
| Agua Destilada | Temperatura de la habitación |
| Muestra de ADN | 4°C |
| 10 x NeBuffer 2.1 | -20°C |
| Enzima de restricción 1 (EcoRI o XbaI) | -20°C |
| Enzima de restricción 2 (SpeI o PstI) | -20°C |
CONSEJOS ANTES DE COMENZAR:
- Al agregar cada reactivo a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml, revuélvalo bien con la punta de la pipeta y siempre cambia tu punta entre pasos - ¡NUNCA sumerge tu punta doble!
- *MUY IMPORTANTE * No dispensar los líquidos en los lados del tubo. ¡Siempre dispense los volúmenes en la parte inferior del tubo!
- Las enzimas se almacenan en glicerol y nunca se congelan y están listas para ser utilizadas inmediatamente. Nunca deben estar fuera del bloque congelador de mesa o un cubo de hielo. Sin embargo, el búfer debe descongelarse completamente antes de su uso. (Mueva suavemente el tubo y gire el contenido hasta la parte inferior). Se pueden almacenar los tampones a 4°C pero solo durarán dos semanas. ¡Debe mantenerse al día con cuánto tiempo ha estado su búfer a esta temperatura!
Procedimiento: (¡Tómate tu tiempo! ¡Asegúrate de que estás haciendo cada paso correctamente!)
- Pipetear lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml: Los reactivos deben agregarse en el orden especificado (¡el agua es siempre el primer reactivo en agregar! ).
Sistema de reacción de volumen final de 25 ul
Si tu concentración de ADN es demasiado baja puedes aumentar el volumen de reacción a 40-50 ul.
X\(\mu L\) de agua para obtener un volumen de reacción final de 25\(\mu L\)
X es igual a 25 - (NEB+ADN+Enzima 1+Enzima 2)
2.5 tampón\(\mu L\) NEB 2.1
\(Y\ \mu L\) ADN
(usualmente ~300 ng- Use espectrofotómetro para determinar la concentración y calcular el volumen necesario).
Y es igual a 300 ng/Concentración de ADN (ng/ul)
\(1\ \mu L\)BioBricks enzima 1 (ya sea EcoRI o SpeI)
\(1\ \mu L\) BioRicks enzima 2 (ya sea XbaI o PstI)
2. Mezclar bien pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5x. Sé gentil, y no vórtices. Girar las muestras durante 5 segundos en una microcentrífuga balanceada, o sacudirlas para recoger la mezcla en el fondo del tubo.
3. Incubar a 37 grados durante al menos 1 hora. Las muestras se pueden almacenar a -20 grados en este punto, pero NO se olvide del paso 4 antes de la ligadura.
4. Después de la digestión, incuba sus muestras a 80°C durante 20 minutos (en bloque térmico). Para el montaje 3A es importante que inactives por calor tus muestras después de la digestión. ESTO DEBE HACERSE O NADA MÁS FUNCIONARÁ
5. Ejecuta 5\(\mu L\) de tu muestra digerida en un gel de agarosa para verificar que tu digestión funcionó. (Ver Sección 1.4 para hacer/verter gel de agarosa así como realizar una electroforesis en gel). Asegúrate de ejecutar los controles adecuados con tus muestras en el gel: (1) un pequeño volumen de ADN sin cortar por cada plásmido digerido. (2) Además, ¡corre siempre un carril con DNA Ladder!
Asegúrese de etiquetar y congelar claramente el resto de su digestión. Esto se utilizará para la etapa de ligadura.