1.5: Ligadura de Productos
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Unión de 2 moléculas de ADN catalizadas por ADN ligasa
Este proceso forma un enlace fosfodiéster entre el hidroxilo 3' y el fosfato 5' de las cadenas de ADN adyacentes, creando ADN recombinante. (NEB)
Video ejemplo de realizar una ligadura
| Materiales | Temperatura de almacenamiento |
|---|---|
| Agua | Temp. Habitación |
| Tampón de ligación de ADN T4 10X | -20°C |
| Base plasmídica linealizada (Amp, Chlor, Kan, Tet) |
-20°C |
| Fragmentos de inserción de ADN digerido doble | -20°C |
| ADN ligasa T4 | -20°C |
|
Consejos antes de comenzar: Una cantidad molar igual (1:1) de cada inserto es la mejor. Sin embargo, 1\(\mu L\) de cada inserto digerido se usa comúnmente para la ligadura y obtiene resultados consistentes. Si sus piezas son drásticamente diferentes en tamaño, es posible que desee ajustar la cantidad molar. (Si no está obteniendo buenos resultados/colonias al momento de la transformación, comience a buscar cambiar la relación molar de sus insertos. Utilice Nebiocalculator para calcular las relaciones molares.) |
Procedimiento
1. Descongelar 10X T4 DNA Ligation Buffer a temperatura ambiente y luego guardarlo en hielo hasta que sea necesario. Deje la ADN ligasa (enzima) en el bloque congelador hasta inmediatamente antes de que sea necesaria; ¡manténgalo siempre frío!
2. Siempre agregue agua y búfer primero. El búfer debe descongelarse completamente y mezclarse antes de su uso:
5\(\mu L\) de Agua (agua hasta 10ul, si se ajustan los volúmenes de inserción)
1\(\mu L\) de tampón de ligación de ADN 10X
1\(\mu L\) (25ng) plasmídico linealizado (destino) cadena principal
1\(\mu L\) de inserto A (digerido con enzimas apropiadas/desnaturalizado)
1\(\mu L\) del inserto B (digerido con enzimas apropiadas/desnaturalizado)
1\(\mu L\) de ADN ligasa T4 (enzima real)
3. Incubar a temperatura ambiente durante 1hr a 2hr. Las ligaduras pueden pasar durante la noche o más tiempo si se almacenan a 4° C (refrigeradas). Esto funciona mejor.
4. Inactivar por calor la reacción a 65°C (u 80°C) por 10 minutos. (Opcional pero recomendado por la compañía.)
5. Las muestras pueden almacenarse a -20 °C o usarse inmediatamente en el protocolo de transformación Zippy. Lo mejor es que de inmediato transforme los 5\(\mu L\) de su reacción en un tubo de celdas zippy. (El tampón de ligadura puede reducir la eficiencia de transformación. El uso de más de 5 ul puede disminuir la eficiencia de transformación real)