1.7: Inoculación
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Se toma una pequeña muestra de bacterias de un plato y se coloca en caldo LB para ser utilizada en miniprep ZymoPure o para almacenamiento a largo plazo.
| Materiales | Temperatura de almacenamiento |
|---|---|
| Palillos de dientes estériles | Temperatura de la habitación |
| Caldo LB | Temperatura de la habitación |
| Colonia Aislada de Bacterias Transformadas | Temperatura de la habitación |
Procedimiento:
Utilizando la técnica estéril, seleccionar una colonia aislada de un plato fresco (de menos de siete días de edad) e inocular medio LB-Miller.
- Utilizarás un palillo estéril para recoger la colonia, y simplemente puedes dejar caer todo el palillo en el tubo de cultivo líquido.
- Se le proporcionarán 5 mL estériles de caldo LB para este paso. Puedes agregar el antibiótico requerido al LB antes de inocular con tu colonia (opcional).
- Incubar con agitación durante 8—16 horas a 37°C antes de la cosecha. Esto da como resultado rendimientos máximos de un plásmido de alto número de copias.
(Por lo general, después de la incubación durante la noche, la absorbancia de una dilución de diez veces del cultivo a una longitud de onda de 600 nm (A 600) con una longitud de trayectoria de 1 cm debe variar de 0.10—0.35.)
Estos cultivos ahora pueden ser utilizados en el procedimiento Mini-prep o almacenados a largo plazo en glicerol. (Consulte el Apéndice VI para saber cómo hacer su propio stock de glicerol.)
Crecimiento de cultivos durante la noche — Consejos útiles si estás teniendo dificultades.
Diferentes medios de cultivo también tendrán un profundo efecto en el crecimiento de diferentes cepas bacterianas. La mayoría de los sistemas de purificación de ADN plasmídico son apropiados para cultivos bacterianos cultivados en medio 1X Luria-Bertani (LB). Sin embargo, el uso de un medio LB-Miller que contenga más NaCl producirá rendimientos significativamente mayores y es muy recomendable. Se pueden usar medios más ricos como 2X YT, CIRCLEGROW ® o Terrific Broth para aumentar los rendimientos de plásmidos al aumentar la biomasa para un volumen dado de cultivo. Mantener la biomasa en un rango aceptable para el sistema de aislamiento plasmídico utilizado, ya que la sobrecarga puede dar como resultado una mala pureza y rendimiento del ADN plasmídico